Способ определения АТФазной активности в тромбоцитах Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения степени повреждения АТФазной активности тромбоцитов человека при различных патологических состояниях.

Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа.

Пример1.3мл крови из срединной локтевой вены собирают в пробирку, содержащую 0,5 мл антикоагулянта следующего состава, %: цитрат натрия 2,5; лимонная кислота 1,4; Д-глюкоза 2. После осторожного перемешивания кровь центрифугируют при 150д в течение 9 мин. Полученную при этом обогащенную тромбоцитами плазму (около 1 мл) отбирают в другую пробирку и центрифугируют при 350д 7 мин. Осадок тромбоцитов суспендируют в 0,3 мл свежеприготовленной среды, содержащей мМ;

NaCI 150; KCI 2,7; MgCl2 1; HEPES - NaOH 10(pH 7,3 при 37°С), 0,35%-ный бычий сывороточный альбумин; гепарин 120 ед/мл. Все операции проводят в пластиковой посуде при комнатной температуре. Количество

клеток в полученной суспензиии составляет 109/мл (содержание белка тромбоцитов 2 мг/мл). Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят в течение 60 мин после их получения, при этом суспензию тромбоцитов хранят при 37°С. Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят путем измерения гидролиза АТФ в стандартной среде энзиматическим методом по окислению НАДН. В снабженную ме- шалкой термостатируемую кварцевую кювету регистрирующего спектрофотометра помещают 3 мл стандартной среды инкубации (реакционной среды), содержащей, мМ- NaCI 80; 15 KCI; NaNsS; MgCl23: HEPES - NaOH 10 (pH 7,2 при 37°С); НАДН 0,2, фосфоэнолпируватО,25; АТФ 50мкМ; пиру- ваткиназа 2 ед.акт., лактатдегидрогеназа 6 ед.акт., бычий сывороточный альбумин 0,5 мг/мл. Затем включают самописец спектрофотометра и на бумажной ленте самописца устанавливают фоновое поглощение реакционной среды при 340 нм и чувствительности, равной 0,1 ед. оптической плотности на всю шкалу самописца (250 мМ). Не останави

с

СА

О

ливая движение ленты самописца, в реакционную среду вносят 50 мкл суспензии тромбоцитов, содержащей 0,5 108 клеток (100 мкг белка) и 6 ед. гепарина, затем вносят 3 мкл раствора аламетицина (25 мг/мл в 60%- ном этаноле) и 3 мкл раствора детергента дуброла РХ (25 мг/мл в воде). Регистрацию уменьшения оптической плотности реакционной среды на ленте самописца проводят 6-7 мин. Измерение АТФазной активности проводят два раза.

Для расчета АТФазной активности используют линейный участок записи уменьшения оптической плотности, который начинается через 2-3 мин после добавления луброла РХ. За 2 мин реакции на линейной стадии средний сдвиг пера самописца составляет для донора А 25 мм или 0,005 ед. оптической плотности за 1 мин (Д Оз4о). Величина удельной АТФазной активности в тромбоцитах донора А, рассчитанная по формуле

АР 340 3 1000

6,22мг белка

составляет 24,1 нмоль Р/мин мг белка тромбоцитов.

Пример 2. 6 мл крови из срединной локтевой вены собирают в пробирку, содержащую 1 мл антикоагулянта следующего состава, %: цитрат натрия 2,5; лимонная кислота 1,4; Д-глюкоза 2. После осторожного перемешивания кровь центрифугируют при 160 g в течение 9 мин. Полученную при этом обогащенную тромбоцитами плазму (около 2 мл) отбирают в другую пробирку и центрифугируют при 350 g 7 мин. Осадок тромбоцитов суспендируют в 0,5 мл свежеприготовленной среды, содержащей мМ: NaCI 150 мМ; KCI 2,7; MgCIa 1; HEPES - NAOH 10 (рН 7,3 при 37°С), 0,35%-ный бычий сывороточный альбумин; гепарин 120 ед/мл. Все операции проводят в пластиковой посуде при комнатной температуре. Количество клеток в полученной суспензии равно 1,5 109 /мл (содержание белка тромбоцитов 3 мг/мл). Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят в течение 60 мин после их получения, при этом суспензию тромбоцитов хранят при 37°С.

Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят путем измерения гидролиза АТФ в стандартной среде энзиматическим методом по окислению НАДН. В снабженную мешалкой термостатируе- мую кварцевую кювету регистрирующего спектрофотометра помещают 3 мл стандартной среды инкубации (реакционной среды), содержащем мМ: NaCI 80; KCI 15; NaNs 5; MgCl23;HEPES-NaOH10(pH7,2npn37°C); НАДН 0,2; фосфоэнолпируват 0,25; АТФ 50 мкМ, пируваткиназа 2 ед. акт., лактатдегидрогеназа бед. акт..бычий сывороточный альбумин 0,5 мг/мл. Затем включают самописец спектрофотометра и на бумажной ленте самописца устанавливают фоновое поглощение реакционной среды при 340

нм и чувствительности, равно 0,1 ед. оптической плотности на всю шкалу самописца (250 мм). Не останавливая движение ленты самописца, в реакционную среду вносят 50 мкл суспензии тромбоцитов, содержащей

0,75 108 клеток (150 мкг белка) и 6 ед. гепарина, затем вносят 3 мкл раствора детергента луброла РХ (25 мг/мл в воде). Регистрацию уменьшения оптической плотности реакционной среды на ленте самописца

проводят 6-7 мин. Измерение АТФазной активности проводят два раза. Для расчета АТФазной активности используют линейный участок записи уменьшения оптической плотности, который начинается через 2-3

мин после добавления луброла РХ. За 2 мин реакции на линейной стадии средний сдвиг пера самописца составляет для донора Б 44 мм или 0,0088 ед. оптической плотности за 1 мин ( Д0з4о). Величина удельной АТФазной активности в тромбоцитах донора Б. рассчитанная по формуле A D 340 3 1000

6,22 мг белка составляет 28,2 нмоль Р/мин мг белка

тромбоцитов.

Чувствительность повышается в 2 раза. Формула изобретения Способ определения АТФазной активности в тромбоцитах путем инкубации клеток в среде, содержащей аламетицин с последующей регистрацией оптической плотности, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, инкубационная среда дополнительно содержит луброл и гепарин, при этом используют аламетицин в конечной концентрации 2-25 мг%, гепарин 1,5 ед/мл на (0,4-1)108 тромбоцитов.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения АТ- Фазной активности тромбоцитов человека при различных патологических состояниях, а также для диагностики ряда заболеваний человека. Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа - достигается за счет использования в процессе инкубации клеток аламетицина в концентрации 2-25 мг %, гепарина не менее 1,5 ед/мл, луброла РХ 25 мкг/мл.