Способ определения активности эпоксидгидролазы Советский патент 1990 года по МПК G01N30/04 

Изобр-тение относится к биотехнологии и мсжст быть использовано для излучения активности и свойств фермеь та эпокси,ц нцролаэы в различных оргэ нах и тканях.

Цель изобретения - упрощение способа и увеличение его чувствительности, Способ заключается в том, что после проведения ферментной реакции образовавшийся фенилэтиленгликоль (ФЭГ) экстрагируют из инкубационной смеси н-бутиловым спиртом,.аликвоту бутано- ла без предварительного концентрирования подвергают анализу методом ВЭЖХ в системе гексан-изопропиловый спирт- вода (80:28:2) и проводят детектирование ФЭГ прл лл л волн. Г,п , м

Способ осуществляется следующим образом.

В инкубационную смесь, состоящую из 0,15 М трис-HCl буфера (рН 8,7) и ферментного препарата (микросом |), вносят стиреьоксид, растворенный в ацетонитриле. После инкубации при 37°С пробы переносят в ледяную баню, добавляют н-бутиловый спирт и насыщенный раствор (NH4)2S04, встряхивают и аликвоту бутилового спирта отбирают для хроматографического анализа. Для определения уровня неферментного - гидролиза стиреноксида параллельно опытным ставят контрольные пробы, отличающиеся от них только тем, что ферментный препарат предварительно подвергают Нгчгрряяни - при 100 С в течеел

о

CD |

ние 5 мин. Для анализа алкивот бутилового спирта на содержание ФЭГ используют жидкостный хроматограф, колонку с силикагелем U trasphere - si, в качестве подвижной фазы используют систему гексан - изопропиловый спирт- вода (80:28:2) при скорости потока 1,5 мл/мин. Обнаружение ФЭГ осуществляют с помощью УФ-детектора при дли- J не волны 210 нм. Количественное определение ФЭГ проводят с помощью интегратора с использованием внешнего стандарта ФЭГ.

Активность эпоксидгидролазы (А) 1 рассчитывают по формуле

Р -Рi

(нмоль/минна 1 мг белка),

где Р - количество ФЭГ, образовавшееся в опытных пробах, в ре- 2 зультате ферментного гидролиза, нмоль;

Р - количество ФЭГ, образовавшееся в контрольных пробах в результате неферментного ролиза;

t - время инкубации, мин; п - количество белка, внесенного

в инкубационную смесь, мг. . Пример. Определение актив- ности микросомальной эпоксидгидролазы печени крыс.

Для выделения фракции микросом печень после декапитации животных немедленно извлекают, тщательно промывают 0,154 М КС1, измельчают путем про- давливания через перфорированную пластину и гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера-Эльвейема (тефлон-стекло, 1200 об/мин, 90 с), используя в качестве среды для гомогенизации 0,154 М КС1, содержащий 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4) в отношении 1:3 (вес/объем ). Все процедуры проводятся при 4°С. Гомоге- наты подвергают центрифугированию при lOOOOgB течение 20 мин при 4°С. Надо- садки переносят в центрифужные охлажденные пробирки и подвергают центрифугированию при 105000g в течение 60 мин. Полученный осадок - фракцию микросом ресуспендируют в среде, используемой для гомогенизации из расчета: частицы из 1 г ткани в 8 мл среды.

В опытные пробирки добавляют 0,34 мл 0,15 М Трис-HCl буфера (рН 8,7) и 0,05 мл суспензии микросом, прогре- . йают в течение 2 мин при 37°С на вод-| ной бане, после чего вносят 0,01 мл

с

5

0

0

50 мМ стнреноксида, растворенного в ацетонитриле. R контрольных пробирках суспензию микросом прред добавлением нагревают при 100°С в течение 5 мин.

Опытные и контрольные пробирки инкубируют в течение 15 мин при 37 С, затем переносят в ледяную баню и добавляют по 1 мл н-бутилового спирта и 0,5 мл насыщенного раствора (NH4)aS04, встряхивают в течение 10 с и отбирают по 5 мкл н-бутилового спирта для хроматографического анализа. Для анализа использован жидкостной хроматограф Altex модель 332, колонка (25 см «4,6 мм) и предколонка ( 4, 5 см 4,6 мм) с силикагелем Wtrasphere-si (размер частиц 5 мкм) в качестве подвижной фазы использую- систему гексан - изопропиловый спирт - вода (80:28:2) при скорости потока 1,5 мл/мин. Обнаружение ФЭГ осуществляли с помощью УФ-детектора Kratos-SF-757 при длине волны 210 нм (0,005 AtfFS, конст. времени 0,5 с). Время удерживания составляет для ФЭГ 4 мин. Количественное определение ФЭГ проводят с помощью интегратора Shimadzu С-РПА с использованием внешнего стандарта (коммерческого порпапата ФЭГ).

Предел обнаружения ФЭГ согласно способу составляет 5 нмоль во вколе. Расчет активности эпоксидгидрола- эы: количество ФЭГ, образовавшегося в результате ферментного гидролиза (Р0), составляет 17,7 нмоль; количество ФЭГ, образовавшегося в результате неферментного гидролиза (Рк), составляет 1,6 нмоль; время инкубации 15 мин.

Количество микрогомального белка, добавленного в пробу, составляет 0,12 мг

нмоль/мин на

.1 мг белка

Результаты пяти параллельных определений представлены в табл. 1,

Среднее значение согласно табл.1 активности эпоксидгидролазы составляет 9,54 нмоль/мин на I мг белка, коэффициент вариации метода 3,7%,

П р и м е р 2. Определение степени извлечения ФЭГ.

В пять пробирок,, содержащих 0,34 мл 0,15 М Трис-HCl буфера (рН 8,7) и 0,05 мл суспензии микросом, добавляют 6 мкг (43,5 нмоль ФЭГ - коммерческий препарат) в 0,01 мл ацетонитрила Экстракцию и количествен- иое определение ФЭГ проводят, как в примере .

Результаты содержания ФЭГ сведены в табл, 2.

Таким образом, степень извлечения ФЭГ из инкубационной смеси составляет 92,2+0,8%.

П р и м е р 3. Определение степени извлечения ФЭГ в отсутствии сульфата аммония и при его разных соотношениях.

В 8 пробирках, содержащих по 0,34 мл 0,15 М Трис-HCl буфера (рН 8,7) и 0,05 мл суспензии микросом, добавляют 6 мкг (43,5 нмоль) ФЭГ (комИрипеденные подвижные фазы характеризуются приблизительно одинаковым временем удерживания ФЭГ.. Форма пиков ФЭГ правильная (распределение Гаусса), за пределами указанных соотношений компонентов, время удерживания может значительно изменяться, пик ФЭГ уширяется, приобретает перегибы при уменьшении доли воды в подвижной фазе происходит раздвоение пика ФЭГ, что объясняют возрастанием роли конкурентного адсорбционного механизма хроматографии (на активных центрах 15 силикагеля) по сравнению с распределительным (в планке воды),

10

мерческий препарат в 0,01 мл ацето-.Таким образом опт„мальным являетнитрила. Экстракцию и количественноеся соотношение КОМПОнентов подвижной

определение ФЭГ проводят, как в при- гекСанизопропанол - вода 76-84:

мере 1 , добавляя ц каждые 2 пробирки„, ог . 0 0 г „ :zt -jU:I,o-/,o.

разный объем насыщенного водного раствора сульфата аммония (4 определения в двух пов1-орениях).

Результаты определения представлены в табл. 3,

Формула изобретения

25

Способ определения активности эпок- сидгидролазы, предусматривающий выде ление микросомной фракции из клеток печени, проведение ферментной реакции со стиреноксидом, выделение продуктов

Таким образом, максимальная степень извлечения (92,3%) ФЭГ наблюдается при -использоьании в процессе экстракции 0,5 мл насыщенного раствора 30 реакции экстракцией органическим рас- сульфата аммония. Близкие значениятворителем, их идентификацию и колиСпособ определения активности эпок сидгидролазы, предусматривающий выделение микросомной фракции из клеток печени, проведение ферментной реакции со стиреноксидом, выделение продуктов

Ирипеденные подвижные фазы характеризуются приблизительно одинаковым временем удерживания ФЭГ.. Форма пиков ФЭГ правильная (распределение Гаусса), за пределами указанных соотношений компонентов, время удерживания может значительно изменяться, пик ФЭГ уширяется, приобретает перегибы, при уменьшении доли воды в подвижной фазе происходит раздвоение пика ФЭГ, что объясняют возрастанием роли конкурентного адсорбционного механизма хроматографии (на активных центрах 5 силикагеля) по сравнению с распределительным (в планке воды),

Формула изобретения

реакции экстракцией органическим рас- творителем, их идентификацию и колиСпособ определения активности эпок- сидгидролазы, предусматривающий выде ление микросомной фракции из клеток печени, проведение ферментной реакции со стиреноксидом, выделение продуктов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изучения активности и свойств фермента эпоксидгидролазы в различных органах и тканях. Целью изобретения является упрощение способа и увеличение его чувствительности и точности. Способ заключается в том, что после проведения ферментной реакции образовавшийся продукт-фенилэтиленгликоль (ФЭГ) экстрагируют из инкубационной смеси н-бутанолом, аликвоту бутанола без предварительного концентрирования подвергают анализу методом ВЭЖХ в системе гексан-изопропиловый спирт-вода (76-84):(26-30):(1,8-2,6) и проводят детектирование ФЭГ при длине волны 210 нм.

степеней извлечения наблюдаются и при использовании больших количеств раствора сульфата аммония, однако из экономических соображений в способе используют минимальный его объем (0,5 мл).

.II р и м е р 4. Определение активности микросомальной эпоксидгидролазы печени крыс при различном соотношении компонентов подвижной фазы.

Выделение микросом и определение .активности эпоксидгидролизы проводят, как в примере , но при соотношениях

компонентов, приведенных в табл, 4. 45 тектированием при длине волны 210 нм.

I

Таблица 1

чественную оценку методом , отличающийся тем, что, с цел-.1 упрощения способа и увеличение его

чувствительности, выделение продуктов ферментативной реакции осуществляют экстракцией н-бутанолом в присутствии сульфата аммония, а при идентификации и количественной оценке методом ВЭЖХ

аликвоты бутанольного экстракта используют силикагельную фазу и системы растворителей гексан-изопропанол - вода при объемном соотношении растворителей 76-84:26-30:1,8-2,2 с Уф-де

Таблица2 .

Пробир- , нмоль I Степень иэ- ка,№I влечения, %

141,0193,3

240,3392,7

338,7089,0

440,6593,4

540,2992,6

ТаблицаЗ

Иробир- Объем добавлен-Среднее знака, № ного растворачение сте- сульфата а жо пени извле- ния, млчения ФЭГ, %

1-2078,7

3-40,592,3

5-60, 789,9

7-81 092,0

Т л и ц а 4 .. - . .„

Состав под- I Соотношение Время удер- вижной фазы х.ионентов жания, мин

Гексан-изопропанол-вода 76:26:1,8 3,8-4,6

То же80; 8:23,8-4,6

То же84-30;2,2 3,8-4,6