Способ получения лейциновой т-РНК Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии, В частности, к способам вьщеления индивидуальных транспортных Рибонуклеиновых кислот (тРНК) .

Целью изобретения является упрощение способа и повьшение чистоты тРНК.

Способ заключается в том, что выделяют тРНК, проводя реакцию амино- ацилирования выделяемой тРНК, связывают аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК, отделяют образовавшийся продукт от несвязанных тРНК, проводят щелочной гидролиз и осуществляют дальнейшее выделение тРНК, при- этом реакцию связывания аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК проводят с альдоенолдекстраном мол. мае. 500000 и степенью окисления 25-50 при рН 5,5-6,0, а стадию отделения образовавшегося продукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлю- лозе.

И р и м е :Р 1. Получение альдо- енолдекстрана мол. мае. 500000 и степенью окисления 25.

К 2,4 г декстрана мол. мае. 500000, растворенного в 50 мл дистиллированной ВОДЫ, добавляют 2,1 г периодата натрия, растворенного в 50 мл HjO, рН реакционной среды доводят до 3 бикарбо)атом натрия. Реакцию ведут 1 сут. От низкомолекулярных примесей избавляются 10-дневным диализом против дистиллированной воды с рН 5,8. Получают 12U m готового продукта с концентрацией 15 мл .льдо- енолдекстрана на 1 мл раствора.

Данный продукт хранится без изменений В течение 6 мес. при 4 С. Определяют количество альдогидридных групп. Оно равно 50 на 100 звеньев декстрана, соответственно степень окисления декстрана равна 25.

Синтезируют альдоенолдекстран структуры

СП о

s3

со со

750

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам выделения индивидуальных транспортных рибонуклеиновых кислот (тРНК). Целью изобретения является - упрощение способа и повышение чистоты выделением МРНК. СПОСОБ ЗАКЛЮЧАЕТСЯ В ТОМ, ЧТО РЕАКЦИЮ СВЯЗЫВАНИЯ АМИНОГРУППЫ АМИНОКИСЛОТНОГО ОСТАТКА АМИНОАЦИЛИРОВАННОЙ ТРНК проводят с альдодекстраном, а стадию отделения образовавшегося продукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе.

которьш является удобным высокореакционным реагентом для связывания с аминогруппой аминоацилированной

тРНК.

Пример 2. Выделяют лейцино- вую тРНК из Escherichia coli на ДЕАЕ-целл1олозе.

Связывают акшногруппы аминолейци- новой тРНК с альдоенолдекстраном.

Аминоацилирование лейциновой тРНК проводят с лейцином, меченным по С. К 240 ед. суммарной тРНК, в составе которой находится аминоацилированная лейциновая тРНК,,растворенной в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мл водного раствора альдоенолдекст- рана концентрации 15 мг в 1, мл. Для удаления РНКаз из реакционной смеси добавляют 4 мг бентонита. Реакцию ведут в течение 48 ч (рН дистиллированной воды 5,5-6,0) при 4®С.

.Стадия вьщеления декстранамино- ацилированиой тРНК. Для отделения декстран-лейциновой тРНК от избытка .альдоенолдекстрана и непрореагировавших тРНК реакционную смесь наносят на колонку, заполненную ДЕАЕ-целлю- лозой, размером 12 с1 см, Элюирование сначала проводят низкой ионной.силой 50 МКоАс буфером, рН 4,5 и 0,2 М NaCl (буфер К- 1). При этом выходит альдоенолдекстран и декстранлейциновая тРНК.

После достижения нулевой плотности ( нм) проводят смену злюирую- щего буфера: 50 М КоАс, рН 4,5 и 1,5 М NaCl (буфер № 2). Высокой ион- ной силой вымывается вся непрореагировавшая тРНК. Контроль за вымывание с колонки продуктов проводят по измерению плотности на А {.о радиоактивности по С.

По плотности вьшывают 12 ед. тРНК (3 ед. плотности - вклад поглощения альдоенолдекстрана)9 т.е. 100% индивидуальной лейдиновой тРНК, по актив Д10СТИ - 85% (следует учесть, что наличие соли при выделении гасит счет)

фракцию (с 10 по 18 мл), содержащую декстра1тейциновую тРНК, гидро лизуют по сложноэфирной связи при рН 8,9 в трисовом буфере в течение 12 ч

0

0

5

0

5

0

5

при 20 С. Смесь после гидролиза наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой. Элюирование отгидролизованной декст- ранлейциновой аминокислоты проводят буфером Р 1, Элюирование деацилирован- ной лейциновой тРНК проводят буфером ,№ 2, Лейциновую РНК переосаждают из этанола.

Проводят проверку биологической активности вьщеленной лейциновой тРНК с помощью ферментативного аминоацили- рования лейциновой аминокислотой удельной радиоактивностью 1-45 рМ. Обогащение 1200 рМ на 1 ед. лейциновой тРНК, что соответствует мировым стандартам. Для аминоацилирования используют суммарнуй синтетазу и поэтому обогащение получается чуть ниже ожидаемого.

Проверка, чистоты выделяемой тРНК. Для подтверждения чистоты выделяемой индивидуальной тРНК проводят электрофорез. Образец тРНК денатурируют в смеси 50% формалина и 6% формальдегида в течение 10 мин при . Электрофорез проводят на 10%-ном полиак- риламидном геле в 0,1 М трисборатном буфере рН 8,3 и 7 М мочевине 4ч, 200. Окраска метиленовой синькой. На электрофореграмме видно, что одна полоса соответствует лейциновой тРНК, отсутствие других полос указывает на высокую степень очистки индивидуальной тРНК, а также на то, что выделяемая по предлагаемому способу тРНК в процессе очистки не деградирует.

Для проверки чистоты вьщеленной тРНК проводят исследования взаимодей ствия неаминоацилированньгх тРНК с альдоенолдекстраном.

К 240 ад. неаминоацилированной тРНК, растворенной в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мл водного раствора альдоенолдекстрана. Условия проведения реакции, как в примере 2. Далее наносят на ДЕАЕ-целлюлозу и моют буфером № 1. С колонки вымывается чистьй альдоенолдекстран, не связанный ни с одной.тРНК, что свидетельствует об отсутствии примесей

других тРНК в вьщеленной индивидуальной тРНК, а значит, и ее чистоте.

Аналогично выделению лейциновой тРНК проводят вьщеление любой из 20 аминокислот.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокую чистоту индивидуально вьщеляемых тРНК., высокий ( х/100%) выход. Способ прост в осуществлении, так как не содержит ника- ких уникальных операций и сложного оборудования, используются отечественные препараты. Формула изобретения

Способ получения лейциновой тРНК, включающий вьщеление тРНК, проведение аминоацнлирования тРНК, связывание аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК, отделение образовавшегося продукта от несвязанных тРНК, проведение щелоч- ного гидролиза и дальнейшее выделение тРНК, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа

и повышения чистоты тРНК, связывание аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК проводят с альдодекстраном мол. мае. 500000 и степенью окисления 25-50 при рН

5,6-6,0, отделение образовавшегося продукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе.