Способ выделения рекомбинантного интерлейкина-2 из бактериальных клеток Советский патент 1991 года по МПК C12P21/00 C12N15/00 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения рекомбинантного интерлейкина-2 из биомассы бактериальных клеток, содержащих ген интерлейкина-2 человека в составе рекомбинантной плазмид- ной ДНК, и может найти применение в медицинской и микробиологической промышленности.

Цель изобретения - повышение выхода интерлейкина-2 и упрощение способа.

Способ выделения рекомбинантного интерлейкина-2 (рИЛ-2) заключается и следующем.

Биомассу E.coli RRI/pAC 262-33 (ВКПМ) суспендируют в 50 ммоль трис- НС1 (рН 8,5), содержащем 5 ммоль ди- тиотрейтола (ДТТ), 1 ммоль Фснипме- тилсульфонилфторида фильтруют через марлевый фильтр, клетки бакге- рий разрушают на Френч-проссе

(700 атм). Осадок отделяют центрифугированием и промывают в следующей последовательности: сначала 50 ммоль трис-HCl (рН 8,5), 5 ммоль ДТТ, 1 ммоль ЭДТА (буфер А), затем этим же буфером, содержащим 2 М и 4 И мочевину. Осадок отделяют центрифугированием и растворяют в присутствии 27,- ного додецилсульфата натрия. Полученный раствор фракционируют на Се- фчдексе G-100. Фракции, содержащие рИЛ-2, диализуют против буфера А.

Раствор рИЛ-7 наносят на колонку с иммобилизованным лизоцимом, уравновешенную буфером А, промывают ее тем же буфером, содержащим 0,1% додеиилсулыЬата натрия, при этом элюируют неснятавшиеся примесные бактериальные белки. рИЛ-2 элюируют буферным раствором А, содержащим 0,5% лолрнш-сульфата натрия.

О

с

о к

N

О X О

Далее следует стадия ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сервацеле, с которой рИЛ-2 элюируют линейным градиентом 0-1,5 М NaCl в буфере А. рИЛ-2 BbixoAHf с колонки при концентрации NaCl 0,8 М.

Пример 1. 150 г клеток Е.со- li RR1/pAC 262-33, содержащих рИЛ-2 в виде нерастворимых тел включения, суспендируют в 600 мл буферного раствора А, гомогенизируют на френч- прессе при давлении 700 атм. Полученную суспензию центрифугируют 30 мин при 12000 об./мин на центрифуге. Осадок ресуспендируют и по 3-4 раза промывают сначала буфером А с последующим центрифугированием в описанном режиме, затем буфером А, содержащим 2М мочевину, и буфером А, содержащим

4М мочевину. Осадок суспендируют в 40 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, при перемешивании растворяют, прогревают 2 мин при

60 С, охлаждают до комнатной темпе- ратуры и тестируют иммунохимическим или биологическим методом.

Раствор рИЛ-2 наносят на колонку 2 К 100/100 с сефадексом Г,-100, уравновешенную 50 ммоль трис-НС1 (рН 8,5) с добавками 5 ммоль ДТТ, 1 ммоль фенилметилсульфонилфторида и 1% додецилсульфат натрия. Фракции, содержащие рИЛ-2, объединяют и диа- лизуют против буфера А. Выход рИЛ-2 составляет 80%.

Отдиалиэованный раствор с концентрацией 3-4-10 -МЕ/мл наносят на колонку К 50/30 с иммобилизованным лнзоци- мом, приготовленным следующим обра- эом.ч

CNBr -активированную сефарозу 4В замачивают в 1 ммоль НС1 и суспендируют в 0,1 М растворе бикарбоната натрия, после чего к сорбенту добав- ляют раствор лизоцима. Иммобилизацию проводят в течение 12 ч при 4 С. Концентрация лизоцима при составляет

5мг/мл сорбента. Сорбент отмывают от несвязавтегося лизоцима сначала 0,1 M раствором бикарбоната натрия, а ча- тем 0,1 М раствором ацетата натрия.

Сорбцию рИЛ-2 проводят из 50 ммоль трис-HCl (рН 8,5), яалсе колонку

промывают тем же буфером, содержащим( 0,1% додецилсульфата натрия. Элюиро- вание рИЛ-2 проводят раствором 50 ммоль трис-HCl (рН 8,5) , содержащим 0,5% додецилсульфата натрия. Элю- ирование продукта контролируют спектр фотометрически и иммуноферментным методом анализа. Выход рИЛ-2 на этой стадии составляет 80-90%.

Раствор рИЛ-2, полученный после аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным лизоцимом, разбавляют буфером А в 10 раз и наносят на колонку с ДЕАЕ-сервацеллом (кллонка К 50/100), промывают буфером А. Элюиро- вание рИЛ-2 осуществляют градиентом 0-1,5 М хлористого натрия в том же буфере. Выход рИЛ-2 составляет 50-55%

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход целевого продукта до 50-55% и упростить способ ег получения, при этом степень очистки в расчете на удельную активность интер- лейкина-2 составляет 3,010 МЕ/мг. Формула изобретения

Способ выделения рекомбинантного интерлейкнна-2 из бактериальных клеток путем разрушения клеток, экстракции белков раствором мочевины, растворения полученного осадка в растворе, содержащем додецнлсульфат натрия, гель-хроматографии растворенных белков и последующей очистки целевого продукта, отличающийся тем что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, экстракцию белков проводят последовательно в растворах 2 М и 4 М мочевины, осадок растворяют в буфере А, содержащем 50 ммоль трис-HCl (рН 8,5), 5 ммоль дитиотрейтола, 1 ммоль фенилме- тилсульфонилфторида, 2% додецилсульфата натрия, а очистку целевого продукта проводят сорбцией белков на колонке с лизоцим-сефарозой в растворе 50 ммоль трис-HCl (рН 8,5) и элюцией целевого продукта тем же раствором, содержащим 0,5% додецилсульфат натрия, а затем сорбцией белков в буфере А на колонке с ДЕАЕ-сервацеллом и элюцией градиентом 0,0-1,5 М хлористого натрия и буфере А.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицинской и микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 и упрощение способа. Способ включает разрушение биомассы клеток на френч-прессе, экстракцию бактериальных белков буфером, содержащим 2 М и 4 М мочевину, растворении осадка рекомбинантного интерлейкина-2 в 2%-ном растворе додещшсульфоната натрия, хроматографию на Сефадексе G-100, хроматографию на лизоцим-се- фарозе и хроматографию на сервацеле. Выход рекомбинантного интерлейкина-2 человека составляет 50-55%. с S