ДИГЛИКОПЕПТИД ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ С МЕТИЛОВЫМ ЭФИРОМ L-ВАЛИНА, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ Российский патент 2004 года по МПК C07J63/00 A61K31/704 A61P37/02 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, конкретно к дигликопептиду глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром L-валина формулы (I), стимулирующему первичный иммунный ответ.

Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение, заключается в поиске новых соединений в ряду производных глицирризиновой кислоты (ГК), обладающих иммуностимулирующей активностью. В заявленном техническом решении синтезировано новое химическое соединение - дигликопептид ГК с метиловым эфиром L-валина формулы (I), стимулирующим первичный иммунный ответ (выработку антителообразующих клеток, АОК).

Способ получения предлагаемого соединения (1) заключается в том, что ГК (II) обрабатывают N-гидроксисукцинимидом (HOSu) и N₁N¹-дициклогексилкарбодиимидом (ДСС) в диоксане при 0 - +5°С в течение 3 ч при мольном соотношении реактивов ГК: HOSu: ДСС=1:4:2 ммоль, выдерживают 8-10 ч в холодильнике при +4 - +8°С, отфильтровывают осадок дииклогексилмочевины, а к фильтрату прибавляют 2,5-2,7 ммоль гидрохлорида метилового эфира L-валина и избыток третичного основания (триэтиламина) (1 мл). Смесь выдерживают при 20-22°С, с периодическим перемешиванием в течение 15-20 ч, разбавляют холодной водой, подкисляют лимонной кислотой до рН-4, осадок отфильтровывают и сушат. Очистку продукта проводят хроматографией на силикагеле L (40/100 мкм, Чехия), элюируя смесью СHCl₃-MeOH-H₂O, 200:10:1, 100:10:1 (50:10:1) (V%). Выход дигликопептида (I) составил 60%.

Острая токсичность дигликопептида (I) определялась на белых беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г при однократном внутрибрюшинном введении. Параметры токсичности вычислялись по Литчфильду и Уилкоксону [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта (2-е изд., перераб. и доп.). Ленинград, 1963. С.152].

Острая токсичность (LD₅₀) составила 1100 мг/кг. Данное соединение относится к 3-му классу умеренно-опасных веществ [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта (2-е изд., перераб. и доп.). Ленинград, 1963. С.152].

Влияние дигликопептида (I) на первичный иммунный ответ изучали на беспородных мышах массой 18-20 г по методу Ерне и Нордина [Jerne N.K., Nordin E.A. Plaque formation in by single antibody-producing cells.//Science. 1963. V.140. P.405] в модификации Каннингема [Cunningham A.J., Czenberg A. Further improvement in the plaque technique for detecting single antibody forming cell.//Immunology. 1968. No. 2. P. 599]. Животных иммунизировали внутрибрюшинным введением 5% взвеси эритроцитов барана, через 24 часа после иммунизации внутрибрюшинно вводили гликопептид (I) в дозе 2 мг/кг. О действии изучаемого соединения на гуморальное звено иммунитета судили по количеству антителообразующих клеток (АОК) во всей селезенке, которое подсчитывали визуально по числу зон гемолиза, затем производили пересчет АОК на 10⁶ спленоцитов. В качестве препарата сравнения использовали известный иммуностимулятор класса гликопептидов, N-ацетилмурамоилдипептид (МДП), в дозе 2 мг/кг [Л.А. Балтина, Г.А. Толстиков. Мурамилпептиды. Екатеринбург: УрО РАН, 1998. 348 с.]. Результаты опытов представлены в таблице.

Установлено, что при внутрибрюшинном введении дигликопептид (I) увеличивает количество АОК в селезенке у мышей в дозе 2 мг/кг ~ в 2 раза по сравнению с контролем. Дигликопептид (I) стимулирует гуморальное звено иммунного ответа эффективнее референс-препарата МДП при введении в равных дозах.

Влияние гликопептида (I) на выработку АОК у беспородных мышей

В отличие от МДП соединение (I) менее токсично. LD₅₀ МДП=1000 мкг/мышь [Джексенбаев О.Ш. Биологические свойства синтетических гликопептидов-стимуляторов иммуногенеза неспецифической резистентности.//Жур. микробиол., эпидемиол., иммунол. 1981. №8. С.13]. LD₅₀ для гликопептида (I) 1100 (785÷1540) мг/кг (внутрибрюшинно, мыши), данное соединение относится к III классу умеренно опасных веществ.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Влияние соединения (I) на первичный ответ изучали на 24 беспородных белых мышах массой 18-20 г по методу Ерне и Нордина [Jerne N.K., Nordin E.A. Plaque formation in afar by single antibody-producing cells.//Science. 1963. V.140. P.405] в модификации Каннингема [Cunningham A.J., Czenberg A. Further improvement in the plaque technique for detecting single antibody forming cell. // Immunology. 1968. No. 2. P.599]. Животных иммунизировали 5% взвесью эритроцитов барана (ЭБ) внутрибрюшинно за 4 суток до опыта. Через сутки после иммунизации животным внутрибрюшинно однократно вводили соединение (I) в дозе 2 мг/кг. Через 4 суток (на 5-е) определяли количество АОК во всей селезенке. После инкубации в термостате при t=37°С в течение 2,5 ч подсчитывали визуально число зон гемолиза, соответствующее количеству АОК, и производили пересчет АОК на 10⁶ спленоцитов.

Действие дигликопептида (I) сравнивали с влиянием МДП на выработку АОК (см. табл.) при введении в дозе 2 мг/кг.

На беспородных мышах дигликопептид (I) в дозе 2 мг/кг увеличивает количество АОК по сравнению с контролем в 2 раза. Иммуностимулирующий эффект заявляемого соединения (I) более выражен, чем у МДП.

Пример 2. 3-0-[2-0-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-валина метиловый эфир]-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-L-валина метиловый эфир]-3β,20β)-11-оксо-30-норолеан-12-ен-3-ил-30-карбоновая кислота (I).

К раствору 0,82 г (1 ммоль) глизирризиновой кислоты в 50 мл диоксана при 0 - +5°С прибавили при перемешивании 0,46 г (4 ммоль) N-гидроксисукцинимида и перемешивали при этой температуре 3 ч, выдерживали в течение ночи в холодильнике при +4-+8°С. Отфильтровали осадок дициклогексилмочечины и к фильтрату, охлажденному до 0 - +5°С, прибавили 0,45 г (2,7 ммоль) гидрохлорида метилового эфира L-валина и 0,5 мл (4,9 ммоль) триэтиламина.

Смесь перемешивали при 20-22°С 20 ч, разбавили холодной водой, подкислили лимонной кислотой до рН ~4, осадок отфильтровали и промыли водой. Сухой осадок (1,0 г) хроматографировали на колонке с силикагелем L (40/100 мкм), элюируя смесью СНС1₃-МеОН-Н₂О=200:0:1, 100:10:1, 50:10:1 (V%). Выход 60% (белый порошок). [α]20D

+ 32° (с 0,04; МеОН). ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (ОН, NH); 1740 (СООМе); 1660 (С^II=0); 154=(CONH). УФ-спектр, λ_max МеОН (lg ε):250 нм (4,95). Найдено, %: N 2,72 C₅₄H₈₄N₂O₁₈. Вычислено, %: N 2,67. Спектр ЯМР ¹³С (CD₃ OD, 25°С, 75,5 МГц, 8, м.д.): 40,5 (С1); 90,6 (С3); 56,7 (С5); 34,1 (С7); 63,4 (С9); 202,9 (С11); 129,2 (С12); 171,7 (С13); 46,8 (С14); 28,7 (С16); 48,4 (С18); 45,2 (С20); 39,3 (С22); 29,0 (С23); 17,2 (С24); 17,5 (С25); 19,2 (С26); 24,1 (С27); 29,2 (С28); 29,5 (С29); 180,8 (С30); 105,2 (С1’); 81,8 (С2’); 76,3 (С3’); 73,7 (С4’); 78,0 (С5’); 171,7 (С6’); 105,2 (С1”); 76,1 (С2”); 76,5 (С3”); 73,6 (С4”); 77,3 (С5”); 171,7 (С6”). Фрагменты аминокислот: С1:53,04; 52,93; С2: 173,36; 173,17; С3: 59,29; 58,70; С4: 32,55; С5: 19,73; 19,61.

Таким образом, заявляемое соединение (1) является умеренно опасным веществом, стимулирующим выработку АОК в 2 раза по сравнению с контролем. Иммуностимулирующий эффект гликопептида (I) более выражен, чем у МДП.

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, а именно к дигликопептиду глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром L-валина формулы (I), стимулирующему первичный иммунный ответ.

Заявляемое соединение является умеренно опасным веществом и стимулирует выработку антителообразующих клеток в 2 раза по сравнению с контролем. 1 табл.

Дигликопептид глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром L-валина общей формулы (I)

стимулирующий первичный иммунный ответ.