Способ получения пектолитического ферментного препарата Советский патент 1990 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения пектолитического ферментного препарата с мутант}1он линией Aspergillus niger, находящего применение при извлечении сока из фруктовых и овощных кашиц и при осветлении фруктовых и овощных соков.

Известен способ производства пек- толитического препарата посредством глубинного культивирования штамма вида Aspergillus niger Van Tieghera 8M-68 ДИКЛС на водной питательной среде, содержащей сухой свекловичный

жом, пшеничные отруби, сульфат аммония, двузамещенньп фосфат калия и сульфат магния по оптимальной темпера туре и аэрации, обеспечивающего получение культуральных жидкостей с актив- нос тью 1500 Е/см .

Недостатками способа являются неудовлетворительный уровень пектолити- ческой активности культуральных жидкостей и недостаточно высокий темпера-, турный оптимум действия - 45 С, отражающиеся отрицательно на экономических результатах при производстве и применении.

а о to

00 Oi

00

Цель изобретения - повьшение активности целевого продукта и его термостойкости.

Изобретение заклгачается в проведении ферментации с культурой Aspergil- 1US niger - 8МХ-41, зарегистрированной, в даЮЮ под № 8, полученной после естественного подбора и воздействия на конидии А. niger-8M ультрафиолето- выми лучами с последующим многократным скринингом на базе реализованной энзимной активности при лабораторных ферментациях. Используемьй продуцент имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

На солодовом агаре Aspergillus ni- ger-8MX-41 к 72-му часу оформляет круглые колонии с гладкой кромкой, павшим центром и густыми радиальными складками с желто-коричневой ценТ ральной частью, с d 1,7 см и белой периферией шириной 1,2 см. К 7-м суткам диаметр колонии достигает 9 см. Цвет черный. Центр продолжает быть запавшим, а радиальные складки вьфа- жены более ярко. Культура не выделяет пигмента в среде. Обратная сторона колонии бледно-кремовая..

На картофельном агаре к 72-му часу Aspergillus niger-8MX-41 оформляет .круглые колонии со светло-желтоватой центральной частью с d 0,5 см, за которой следует вторая с d 2,2 см, с черным пигментом и периферийная белая полоса пшриной 3 мм. К 7-м суткам диаметр колонии достигает 7 см. Светлый центр сохраняется, за ним следует окружная черная зона шириной 2,5 см и к самому концу - белая полоса шириной 0,5 см.

На агаре Чапека-Докса Asp. niger- 8МХ-41 оформляет к 72-му часу круглы колонии с d 1,1 см, имеющие белый центр и слегка пигментированную в светло-кремовый цвет поверхность. К 7-и йуткам диаметр колонии достигает 3-4 см с белым центром, за которым следует-кольцо с d 0,7 желто-зелет ного цвета, за которьм расположена 2-сантиметровая зона: с черным пигментом и белая периферийная зона ширино

2.--- 3 ММо:

Культура оформляет конидиеносцы длиной 250 - 500 (U и толщиной 2 - 3,5W, оканчивающиеся сферическими .калумелями с d - ЮО - 200 W и сферическими конидиями с d 1,5 - 2,2fU,

5

0

окрашенными в темно-коричневый до черного цвет и покрытыми шипами длиной 0,2 - 0,5Щ .

На твердой питательной среде Asp. niger-8MX-41 оформляет колонии с хорошо оформленным воздушным мицелием и слабым субстратным мицелием, построенным из септированных хифий.

Культура поддерживается на пологом неохмельном агаризированном сусловом экстракте с 6% сухого вещества.

Различия Aspergillus niger-8МХ-41 от используемой производственной культуры Asp. niger-8M выражаются в значительно более высокой биосинтетической энзимной активности. К 144-му часу своего развития в среде с оптимизированным составом культура 81-Ж-41 накапливает в 1 мл ферментационной жидкости 4000 ± 300 Е полигалактуро- назной активности и 20 i 4 Е пектин- эстеразной активности, а производственная - соответственно 1500 ±. 20 Е/мл ПГА и 4 +0,5 Е/мл ПЭА. .

После проведения многофакторного эксперимента 2 и следующего за этим математического моделирования установлено, что ферментацию целесообразно проводить в среде, имеющей следующий состав, %:

Сухой свекловичный жом4,5 . - 5,5

Пщеничные отруби 0,75 - 1,5 Сульфат аммония 0,35 - 0,75 Фосфат натрия

двузамещенный 0,125 - 0,250 Крахмал , 0,5 -1,5 Сульфат магния 0,025 - 0,05 Хлорид калия 0,025 - 0,05 ВодаОстальное

После отделения мицелия ферментационную жидкость фильтруют с целью устранения механических примесей, освобождают от низкомолекулярных растворимых примесей посредством ультрафильтрации, при этом объем сокращается в 7-9 раз, а сухое вещество увеличивается от 1,2 - 1,5 до. 1,75 - 2%. Следует 8-кратное вакуум-концентрирование при температуре ниже 36 С и ли- офильная или вакуумная сушка при температуре. Не превышающей 38 С.

Полученный ферментный препарат обладает более высокой термостабильно- стью (50°С оптимум действия), трехг кратно более высокой биосинтетической активностью по отношению к полигалаю- туроназе и пятикратно более выс.огада

синтезом пектинэстеразы, что отражается положительно на экономической эффективности производственного процесса и высокой осветляющей активности, препарата, определяющей его небольшой расход и сокращенное время депектинизации.

Пример. К 45 л стерилизованной и охлаязденной до 27°С ферментационной среды, имеющей состав, %: сухой свекловичньй жом 4,5; пшеничные отруби 0,75; сульфат аммония 0,35; фосфат натрия двузамещенньд 0,125; крахмал 0,5; сульфат магния 0,025; .хлорид калия 0,025; вносят 1,5 л 24-: часового инокулята из Asp. niger-8MX- -41 № 8 ДИКЛС, подготовленного в среде, имеюв ей состав, идентичпьй состаот 2,|) до 6,0 причем активность опт мально проявляется при рН 4,5. Оптимальная температура действия при рН рН 4,5 - 5 . Препарат сохраняет 90% своей активности при 50 С в тече ние 60 мин.

ф о рмула изобретения

10

Способ получения пектолитического ферментного препарата, предусматривающий глубинное культивирование про дуцента Aspergillus niger на водной 15 питательной среде, содержащей сухой свекловичный жом, пшеничные отруби, сульфат аммония,,двузамещенную соль фосфорной кислоты и сульфат магния, при оптимальной температуре для био- «xi-ivtvii iii /rj 1 c;iMiit:;|jci 1 JlJln.

ву ферментационной среды, на круговом 20 синтеза фермента и аэрации до максиэксцентрическом встряхивателе с 220 об/мин при 27,5 + 0,5°С.

Ферментация в ферменторе протекает при 27,5 + 0,5 С, аэрация стерильным воздухом при расходе 0,8 - 1,1 л/л среды в 1 мин, при окружной скорости мешалки 2,4 - 3,2 м/с, в течение 144+ ± 8 ч. В конце процесса в 1 см фер- ментационной жидкости накапливаются 4000 + 300 Е полигалактуроназной и 20±4 Е пектинэстеразной активности. После устраненения мицелия, нерастворимых составляющих среды и тонкого фильтрования или сепарирования получают 35 - 37 л ферментационной Ж)1дко- сти, которую подвергают мембранной ультрафильтрации, сокращающей объем приблизительно в 8 раз, 8-кратному вакуум-концентрированию при температуре ниже 38°С и вакуумной или лиофиль- ной сушке при температуре ниже 38°С. Получаются 300 - 350 г препарата с активностью 400000 Е/г ПГА и 2000 Е/г ПЭА, После стандартизации перлитом или диатомитом получаются около 2 кг препарата с 60000 Е/г ПГА и 300 Е/г ПЭА. ..

Полученный пекТолитический препа- рат действует в широких границах рН

25

30

мального накопления активности, отделение мицелия, концентрирование куль- туральной Ж1щкосги ультрафильтрацией и вакуум-концентрированием и сушку, отличающийся тем, что, с .целью повышения активности целевого продукта и его термостойкости, в ка честве продуцента используют штамм Aspergillus niger ДИКСЛ fc 8, культивирование ведут на водной среде, до полнительно содержащей крахмал, хлористый калий и фосфорнокислый двуза- мещенный натрий в качестве двузаме- щенной соли фосфорной кислоты при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Сухой свекловичный

жом

Пшеничные отруби

Крахмал

Сульфат аммония

Фосфорнокислый

двузамещенньй

натрий

Сульфат магния

Хлористьй калий

Вода

40

4,5 0,75 0,5 0,35

-5,5

-1,5

-1,5

-0,75

45

0,125 - 0,250 0,25 - 0,05 0,025 - 0,05 Остальное

причем вакуумирование и сушку осуществляют при 30 - .

1602868

от 2,|) до 6,0 причем активность оптимально проявляется при рН 4,5. Оптимальная температура действия при рН рН 4,5 - 5 . Препарат сохраняет 90% своей активности при 50 С в течение 60 мин.

ф о рмула изобретения

Способ получения пектолитического ферментного препарата, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Aspergillus niger на водной питательной среде, содержащей сухой . свекловичный жом, пшеничные отруби, сульфат аммония,,двузамещенную соль фосфорной кислоты и сульфат магния, при оптимальной температуре для био- - «xi-ivtvii iii /rj 1 c;iMiit:;|jci 1 JlJln.

синтеза фермента и аэрации до макси25

0

мального накопления активности, отделение мицелия, концентрирование куль- туральной Ж1щкосги ультрафильтрацией и вакуум-концентрированием и сушку, отличающийся тем, что, с .целью повышения активности целевого продукта и его термостойкости, в ка честве продуцента используют штамм Aspergillus niger ДИКСЛ fc 8, культивирование ведут на водной среде, до полнительно содержащей крахмал, хлористый калий и фосфорнокислый двуза- мещенный натрий в качестве двузаме- щенной соли фосфорной кислоты при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Сухой свекловичный

жом

Пшеничные отруби

Крахмал

Сульфат аммония

Фосфорнокислый

двузамещенньй

натрий

Сульфат магния

Хлористьй калий

Вода

0

4,5 0,75 0,5 0,35

-5,5

-1,5

-1,5

-0,75

5

0,125 - 0,250 0,25 - 0,05 0,025 - 0,05 Остальное

причем вакуумирование и сушку осуществляют при 30 - .

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения пектолитического ферментного препарата, находящего применение при извлечении сока из фруктовых и овощных кашиц и при очистке фруктовых и овощных соков. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и его термостойкости. Способ получения пектолитического препарата заключается в использовании мутантного штамма ASPERGILLUS NIGER - 8МХ-41, зарегистрированного в ДИКЛС под N8, для культивирования в ферментационной питательной среде, после чего из ферментационной жидкости его концентрируют и сушат при температуре 30-38°С. Преимущества способа заключаются в более высокой термостабильности препарата (50°С оптимум действия), трехкратно более высокой биосинтетической активности по отношению к полигалактуроназе и пятикратно более высоком биосинтезе пектиноэстеразы, что отражается положительно на экономической эффективности производственного процесса, и высокой очищающей активности препарата, определяющей его небольшой расход и сокращенное время депектинизации.