Штамм вируса эпидемического паротита Рубини, используемый для получения живой вакцины против эпидемического паротита, и способ его получения Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 C12N7/08 

Изобретение относится к адаптированным к человеческим клеткам вирусам эпидемического паротита и к способу их получения из вирулентных вирусов эпидемического паротита, выделенным у больных эпидемическим паротитомо

Цель изобретения - снижение реак- тогенности вакцины,,

Для этого -используют ытамм вируса эпидемического паротита Рубини С N С М № 1-503 оШтамм депонирован в коллекции института Пастера С N С М г„ Париж под N 1-503 о

Ытамм вируса эпидемического паротита Рубини С N С М № 1-503 характеризуется следующими озойствамио

Морфология,. Парамиксовирус, эп1аде- мический napoTiiT,

Электронно-микроскогшчески вирус эпидемического паротита штамма Рубини

обнаруживает оболочку и по.пые спиральные нити, образ тащие нуклеокапсид„ Частицы имеют нитеви, структу1эуо

Репликация о Штамм Рубини можно реплицировать в диплоидных клетках человека , например в клетках типа MRC-5 (Cell Bank of the Swiss Serum - and Vaccine Institute Berne). Питательная среда: Basal Medium (Eagle): GIBCO, USA, Cato M G-B), FCS (Rehatuin) 10%„ Среда для сохранения культуры: среда 199: GIBCK, USA, Cat, № Е-12) HSA 0,25% в трипсине 1:250, 0,25% в PBS (рН 7,4) DIFCO, USA

Иммунологические своГ ства приведены в таблице о

Юшническая оценка вак1дины Рубини против эпидемического паротита в смеси с вакциной против кори, содер|яаа4

ю

оо

ы

:жаще11 вирусы кор Л1таммп KZ-19, и (.; 8.:кциной против краснухи.

Физико-химические свойства Пара- миксо1 ирус включает т-еном с по- иерхностью, состоя 1Д111 из GeJiKOii, J:и- пидов и углеводородов. Они жизнеспособны в пределах значений рН 6,0 и 8,0 и вьмшвают 1три темиературах до 45°С при условии, что их защищают добавочными углеводородами (такими как глюкоза, лактоза и/или сахароза),, Полу гение вируса штамма Рубини, Вьщеление и перенос вирулентного вируса эпидемического паротита

Выделение вируса из мочи заболевшего свинкой пациента осуществляют ультрацентрифугированием (А ч, 25000 об/мин)о Полученную фракцию, содержащую вирусы, испытывают в реакции гемагглютинации, культивируют в диплоидной человеческо ткани (например, в культурах типа Wi-38) и в наси женньк куриных эмбрионах. Полученный таким образом вирус свинки затем очищают и концентрируют ультрацентрифуги рова1ием в течение 4 ч при 2.5000 об/ми Аттенуирование и адаптация вируса Для аттенуирования и адаптации вы- шеуказанньй посевной материал вируса эпидемического паротита подвергают дополнительным пассажам в куриных эмбрионах и затем в человеческих клетках, осуществляя следующие операции: неоднократные пассажи в амниоти- ческом или аллантоисном мешках или попеременно в куриных эмбрионах соответственно при 30-35°С (например,32 С

дополнительньк; пассажи в диплоидной человеческой ткани типа MRC-5

при 30 С; ,

повторные пассажи в тканевых культурах этого же типа (1 :01С-5) при 35 С

Получение вакцины 45

Полученньш в результате вышеуказанных следующ1х друг за другом пассажей посевной вирус размножают в диплоидньЕХ человеческих клетках, например .клетках МКС-5„50

Затем собирают взвесь вирусов и перебрасывают ее до готовой к употреб- . лению вакщ1НЫо

В этих целях взвесь осветляют, например, путем центрифугирования или . фильтрации, после чего определяют содержание вирусов, например, в клетках VERO, стабилизируют материал путем добавки сахара, напрн мер глюкозы., лак5

0

. ;

0

5

О

45

50

. тозы и/или сахарозы, после чего ее, наконец, подвергают .Г1иофилиза1р-1и,

Число пассажеГ B ipyca в дип, 1оиднои человеческоГг ткани и в куриных эмбри- osjax MOKiio варьирО1 ать. Температ хфу во время выpaцl I aния и культивирования тоже можно варьировать примерно в пределах 30 и 38 С,.

Лттенуирование и культивирование вирусов преследует две главные цели: ослабление вирулентности вируса с сохранением его антигенных свойств, т„е„ способности вызывать образование антител; /выработка ослабленной куотьтуры 1зирусов, не содержащей постороннего белка, т„е. в данном случае не содерж;зщей птичьих белков, и следов антибиотиков,,

Пример 1 - Получение вируса штамма Рубини.

А. Получение посевного вируса Вирусы эпидемического паротита, полученные к концу времени из мочи заболевшего свинкой больного, очищают путем дисрференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования (4ч, 25000 об/мин) и концентрируют ихс Затем с использованием реакции гемагглю- тина1щи определяют содержащую вирусы свинки фракцию, пешают ее в содержащую белок среду, например Basal Medium Eagle (ВМЕ) фирмы Gibco + 0,4% человеческого сьшороточного альбумина (HSA) , и пoдвepгaJoт дальнейшей переработке с. Монослой диплоидных человеческих клеток (например, из Wi-38) засевают взвесью вирусов свинки и после добавки питательной среды, например ВМЕ + 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) , инкубир тот при 37°Со Через несколько суток собирают вирус Последний еще подвергают 1-4-кратному пассажу в диплоидных человеческих клетках. Далее собранный материал подвергают трехкратному пассажу в куриных SPF эмбрионах с применением различных методов засева и сбора: инокуляптия в гишантоисньш мешок и сбор из него., инокуляция в амниоти- чески11 мешок и сбор из него; ляция в амниотический мешок и сбор из аллантоисного или амниотического мешка соответственное:

Яйца инкубируют при температуре Б пределах 32-35 С, Полученные в результате трех .пассажей в яйцах по 8 вариантам инокуляции и сбора вирусы объединяют „ Объеди11енный материал

516

подверг ают 10 дополнительным пассажа

в яйцах: ииокулируют в амнистический

f

мешок н собирают вирусы из алланто- исиой жидкости Температуру поддерживают при 32°С, Титр антигенов вируса свиь ки в каждом случае определяют в реакции гемагглютинащпи

Затем осуществляются 4 быстрых пассажа в дигшоидных человеческих клетках (HR.C-5) гфи (кащ;ьш пассаж около 7 сут)„ После 9 дополнительных пассажей в клетках МЕ.С-5 при 35° С (на Kajvi,brii пассаж 10-20 сут) получают аттенуированный посевной вирус о

Б,, Проверка посевного вируса о Полученный в результате аттенуиро- вания посевной вирус подвергают испытанию /шя определения идентичности его с вирусом свинки (реаки;ия нейт- рализахши на клетках VERO) и для ус- тановлс.ния его концентрации (титр в клетках VERO: 5,6 log ,о 11 /ып ), Идентификация посевного вируса подт- верж/дает наличие вируса свинки„ Титр указывает на то, что получение вируса на клетках MRC-5 с использованием вируса свинки штамма Рубини возможно о Кроме того, т1жеприведенными тестами подтверждена микробиологическая чистота посевного вируса: тесты на среде жидкого тиогликолята при 30-32 С; отсутствие бактерий; тесты на жзадкой соевой среде при 20-25 0; отсутствие грибков; тесты на жидкой и плотной средах;отсутствие микоплазм, тесты ИИ виво на морских свинках: отсутствие Mycobac.t. tubei culosis; тесты ин виво на жидкой (по Сантону) и на плотной (по Левенштейн-Йенсену) средах: отсутствие М. tuberculosis; тесты на птичий лейкоз: отсутствие ретровирусов; тесты на посторонние вирусы ин виво на обезьянах (Cynomo- logus), морских свинках, мышах, новорожденных мьшах (не старше 24 ч) и криных эмбрионах: отсутствие посторонних вирусов; тесты на посторонние вирусы ин витро на первичной обезьяней почке (Primary monkey kidney) и в диплоидных человеческих клетках (HDC) (1-1RC-5) и Lung-18: отсутствие посторонних вирусов о

В„ Получение вирусов в клетках„ Посевные вирусы размножаются в диплоидных человеческих клетках, например клетках типа MRC-5, в пригодных для крупнопромышленного производства

218

культуральных бутылях, например буты- ля: -качалках. После инкубации при 35 С в течение 7-10 сут и микроскопической оценки культуры (эффект цито- пат(5ге П1ости). собирают взвесь вирусов с суточным интервалом в течение 7 днейс Затем объединенную массу вирусов хранят до получения результатов испытаQ НИИ при -190 С в газовой фазе Ж1едкого азота. Вирусный материал, который по результата испытаний соответствует требованиям, вновь размораживазот и фш:ьтруют до прозрачности с помощью

5 фильтра с размером пор ок, 5 мкмо После разбавлен я вирусного материала стабилизатором, .представляющз м собой раствор лактозы или лактозы и глюкозы, содержавдп человеческий сьшороточ0 ньш альбумин, полу-чают конечньш материал, который порциями по- 0,5 мл разливается в бутылочки емкостью 3 мл и в замороженном состоянии лиофилизует- ся „

.5 Г„ Клинические исследования „

Проведенные сих пор Исследования показывают, что прививка вышеописанным материалом оптимально переносится человеком.-, Повышение температу0 ры шп1 какие-либо местные реакщп не наблюдаются о Чувствительные органы, например околоушные слюнные железы или яички, не показьгаают никаких припухлостей, воспаления или болевых реакций.. За исключе П ем одного все проба)1ды показывают положительную се- роконверсиЮо Единственньш пробанд, у которого при повторном исследовании не удалось обнаружить специфических

ц для свинки антител, локе до этого реагировал отрицательно на комерческие прививоч 1ые материалы против свиню-ь В /фугом клиническом исследовании полученньп вирусньш материал в виде

5 комбинированной вакцины на основе

живого вируса в человеческих диплоидных клетках (HDCV) против свинки, кори и краснухи испытывают Б полевых условиях по методу двойного слепого опыта.

0 В исследован 1е В1слючают всего

120 детей раннего возраста (15-20мес) 60 детям вводят новую вакцину, а контрольной группе из 60 детей - из- вестн; та вакцину против свинки, кори

и краснухи M-M-R Но Через 6-8 не- ; дель после вакщ1нации у обеих групп без исключения устанавливают высокую степень сероконверсии (95-100%)о Мно жественное испытание V -Test пока-

5

-61

г ьпзаст dTcyTCTfiiU стлтис ги-игск; чиаЧИМ011 ,1 ИММуИОГСИпОЙ ЛКТИ)ИОСТИ

лвух вакид) (р 0,05). Из 12 участвующих в тсчииическом исг;ыт иг1и клилик не поступило }1икаких сос Гпценш о ка- ких-,либо побочных дсйстр- ях накцин, HDCV.

Бьию ycTaiioBJicjio, чтс все :омло- ненты HDC обнару;чс1- иают высокую степень аттенутэованггя п что BaKiynia не со;1,ержнт вп птпчьнх белков и экстрактов Ж1вотных бе.ггков, ни антибиотиков. Таким 1бразсь-, отна/ ает все теоретические и практические противопоказания, обуслскленные со- ответств по11п-п-п-1 све1Г счувст1Л1то.л ЬНос- тямис Ни в одном случае --e наблюдается какого-либо побочно О денствиу:

П р и мер 2,

АО В1,деление вирусов :пид,смичес кого паротита, как оппса: -;о в примере 1 ,

Б„ Разм южение вирусов в диплоид-- ных человеческих клетках

Во Аттенуирование вирусов посрс,;;- вом 10 паесажей в диплоидных человеческих клетках при 30--3:) С., 6 пасса- кей попеременно в амкиогическом и аллантопсном мешках куриных эмбрионов при 35-38 с Из наконец., 6 быст- Г ЫХ и 10 обычных пассажс и в ;типлоид- ных чедовечееких кпетках MRC-S при ;Ш-35°Со

8

-

О

5

5

0

Г, Разм)южение нсхчуче пкл О по Л/Б/ /п посонного вируса } дпп чоидных че- ,: I с) 11 е Ч е с к и X кл е т к а х..

Д.. Сбор вирусов, от;и1. гение от KyjTb- среды, оч 1стк;1, ко}пге})тра- UiiH, иснытание, стабпл 1зан,ия и .:гиофи- дптзадия аналогично нримеру 1

Ф о р м у л а и 3 о б р е т е н и я

1,Ытамм вируса энидемпчеслого паротита Рубини С N С М N- 1-503, псполь- зуе. чый /утя получения жив)1 вакцин ; против ;п1идемич еского па1)отпта

2,Способ получения вируса эгпитс- мического наротита, исполи зуемого ДЛП-; приготовления жи1)ой вакни1Н против :шиде:-мч(к:кого паротита., -иепочаю- 1ЦИЙ вы;т;ш1ен ие вируса от больного свинкой, вырашиван-ие его на /ппигозгдап п-: клетках чаяовека; aTTcHyifponainte на ДИШ10ИДНЫХ клтетках челювека и юпщхся курингдх эмбрис.чгах, сбор и накоплю niie вируса, о т Л1 п ч а ю ii и fiс я тем, что, с целью (ппгже1п«1 реак- тоге1П1ости вакгцпнл, впрус нск ле зь;- рапшвания и атте1гуиро 5а}{ия )ia культуре диплоидных челювека и раз- вивакнцпхся куриН1 с : rjM6pj-iOHax аттенуи- руют дополтлител 1П1 1Ми пасс;ажам)- на тех же д -п1Л10идных клетках челютгека п далее собирают и лакаплпшают впруе эпи; ег- и ческого паротита :11таь;м Рубини С N С Л № 1-503,

Изобретение относится к адаптированным к человеческим клеткам вирусам эпидемического паротита, выделенным у больных эпидемическим паротитом. Целью изобретения является снижение реактогенности вакцины. Получение штамма вируса эпидемического паротита Рубини C.N.C.M. N 1 =503 заключается в следующем. Вирус выделяют у больного свинкой, выращивают на диплодных клетках человека, аттенуируют на диплоидных клетках человека и развивающихся куриных эмбрионах, после чего дополнительно аттенуируют на тех же диплоидных клетках человека, собирают и накапливают. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.