Способ получения живой брюшнотифозной вакцины Советский патент 1975 года по МПК C12K5/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ БРЮШНОТИФОЗНОЙ

ВАКЦИНЫ

через 10 дней ту же дозу 10 неактивированных путем часового нагревания до 58°С микробов того же штамма, как усилители.

Определение числа бактерий в печени и селезенке этих животных показали, что аттенюированные бактерии штамма вакцины были элиминированы полностью уже по истечении 20 дней, в то время как бактерии вирулентного штамма, несмотря на меньшую дозу даже по истечении 4 недель были налицо у мышей в концентрациях 10.

Через 6 недель после прививки мышам внутрибрюшинно ввели 10 живых бактерий вирулентного штамма Ту 2. В этот момент все животные были свободны от вакцинных бактерий. Путем определения числа бактерий в печени и селезенке мышей наблюдают за развитием бактерий возбудителей.

Преимушества живой вакцины из эпимиразо-отрицательных мутантов заключаются в том, что одной оральной дачей можно добиться надежного, чрезвычайно сильного, специфического иммунитета против патогенных для человека Salmonella typhi.

Вирулентный штамм Salmonella typhi вырашиваютв 30мл Brain Heart Infision (Difco) в качалочной колбе емкостью 100 мл при 37°С. По истечении 4 ч отделяют центрифугированием клетки бактерий и суспендируют их в физиологическом растворе хлористого натрия таким образом, чтобы суспензия содержала 10 организмов на 1 мл. Эту суспензию облучают УФ-светом до тех пор, пока не будет достигнуто 80%-ное умершвление бактерий. Клеткам бактерий затем повторно прививают свежую Brain Heart Infision (Difco) и их инкубируют при 37°С на качалке. Через 2 ч культуру заражают smooth-специфическими бактериофагами типа FC-1 (1 бактериофаг/10 клеток бактерий) и инкубируют еше в течение 3 ч. Такой обработкой лизируются все smoothбактерии и остаются только rough-бактерии, которые распределяют на агаровую питательную среду и инкубируют в течение 14 ч при 37°С. Образовавшиеся колонии затем реплицируют на эндо-агар, который вместо лактозы содержит 0,2% галактозы. На этой питательной среде можно легко узнать эпимиразо-отрицательные мутанты благодаря их виду роста в колониях: эпимиразо-отрицательные мутанты в противоположность дикому типу не сбраживают галактозу, и они растут в типичных бесцветных, плоских колониях с узким внешним валом и вогнутым центром, состоящим из лизированных клеток. Изолируют 30 из. вышеупомянутых колоний и из них те делеционные мутанты, которые и после мутагенной обработки К-метил-Ы-нитро-М-нитрозогуанидином ((NG) не показывают реверсии.

Для этой цели изолированные мутанты выраш,ивают на Brain Heart Infision, через 6 ч обрабатывают NG с тем, чтобы получить 99%-ное умерщвление.

Оставшиеся в живых клетки после двухкратного отделения центрифугированием и

промывки в Brain Heart Infision суспендируют, инкубируют на качалке при 37°С и по истечении 2 ч распределяют на свежую Brain Heart Infision, к которой добавили 0,1% галактозы.

Из-за дефекта в энзиме ИДР-галактоза-4эпимераза эпимеразо-отрицательные мутанты не в состоянии метаболизировать ноглошенную галактозу. Происходит накопление галактоза-1-фосфата и ИДР-галактозы, вследствие чего по истечении 3-4 ч происходит полный лизис эпимеразо-отрицательных бактерий. Затем еще в течение 3 ч инкубируют культуру, что способствует возникновению редких ревертантов. Оставшиеся в живых бактерии распределяют на содержащий галактозу эндоагар и инкубируют в течение 14 ч при 37°С. Ревертанты можно легко узнать на этой питательной среде в виде сбраживающих галактоЗУ темно-красных колонии.

Окончательно селекционированный мутант выращивают в Brain Heart Infision на качалке при 37°С. По истечение 6 ч бактерии отделяют центрифугированием в охлаждающей

центрифуге без промывки в защитной среде, состоящей из 8% сахарозы, 1,5 желатины и 5% порошка из снятого молока, суспендированной в 1 мл этой суспензии из бактерий, лиофилизируют в ампулы емкостью 5 мл.

Лиоампулу полученного нового вакуумного штамма открывают и штамм выращивают на питательной среде из скошенного агара при 37°С. Бактерии получают с поверхности скошенной агарной культуры и их суспендируют в физиологическом растворе хлористого натрия. Эту суспензию из клеток прививают содержанию колбы Эрленмейера емкостью 1 л. Колба содержит 600 мл питательной среды, которую получают путем растворения

28 г казеингидролизата, 10 г дрожжевого экстракта и 2 г глюкозы в 1 л дистиллированной воды и значении рН 7,2, который получают посредством 1 н. раствора NaOH. Колбу Эрленмейера в течение 6 ч встряхивают при

37°С. Полученную бактериальную культуру распределяют на 25 л полученной среды. Культуру инкубируют в течение 12 ч при 37°С, проветривая ее (5 л воздуха/мин). Рост предварительной культуры и главной культуры определяют нефелометрическим путем. Культурными пробами определяют чистоту. По истечении времени культивирования клетки бактерий отделяют центрифугированием в охлаждаемой центрифуге без промывки, суспендируют в 600 мл защитной среды и порциями по 1 мл лиофилизируют в 5 мл ампулы или в прокалываемые пузырьки. Применяют ее следующим образом: ампулы или прокалываемые бутылки открывают, содержание суспендируют в 3-5 мл холодной или тепловатой воды или молока и дают через рот.

Формула изобретения

Способ получения живой брюшнотифозной вакцины путем выращивания вирулентного 5 штамма Salmonella typhi, отделения культуры и ее лиофилизации в защитной среде, о тличающийся тем, что, с целью получения высокоиммуногенной вакцины, используют в качестве вакцинного штамма мутант Salmo-5 б nella typhi, обладающий блоком уридинфосфатгалактоза-4-эпимеразы и пониженной галактокиназной и галакто - 1 - фосфатуридилтрапсферазной активностью,