Способ раздельного получения бесклеточных экстрактов листьев папортника и цианобактерий из симбиотической системы AZoLLa-АNаваеNа aZoLLa Советский патент 1990 года по МПК C07K1/30 C07K4/10 

Изобретение относится к биохимии растений, в частности к физико-химическим методам получения и анализа растительных белков, и может быть использовано в работах научного и прикладного характера, направленных 1 на изучение общего обмена веществ в

симбиотической системе азолла анабена и обеспечение, более быстрого внедрения этой системы в народнохозяйственную практику (в качестве удобрения для рисовых полей, сырья для получения биогаза, корма для домашних животных).

Целью изобретения является улучшение качества разделения и повышение выхода растворимых белков папоротника и цианобактерий.

Основу предлагаемого способа составляет новая совокупность методических приемов, относящихся преиму- :щественно к режимам гомогенизации фракционирования растительного материала и направленных на устранение условий, которые приводят к взаимному загрязнению двух типов получаемых белков, и обеспечение наиболее полно экстракции растворимых веществ белковой природы.

Способ предусматривает 6 основных стадий: гомогенизацию листьев в фарфоровой ступке, фильтрование го- могената, низкосортное центрифугирование фильтрата, промывание клеток цианобактерий (осадок) центрифугированием, растирание клеток циа.нобак- :терий с песком в фарфоровой ступке, ia также высокоскоростное центрифугирование гомогената цианобактерий и супернатанта после первого центрифугирования фильтрата листьев папоротника.

При точном соблюдении предлагаемых режимов гомогенизации и разделения новый метод обеспечивает получение из 5 г исходного материала 70 мг растворимого белка азоллы и 7 мг растворимого белка анабены, отличающихся выссгким уровнем нативнос- ти и чистоты разделения, которые контролируют электрофоретичес.ки и по активности рибулозодифосфаткарбок сйлазы. Время анализа примерно 2ч,

Пример 1 . Выра1дивание трех видов азоллы (А. pinnata, A.filli- culuides, A.caroliniana) проводят в оранжерее под люминесцентными лампами при 25000 люкс в плоских кюветах (эмалированных), заполненных питательной средой Таллея, не содержащей связанного азота. Питательную среду меняют через три дня. Для опытов используют 7-дневные культуры азоллы, которые содержат в основном вегетативные клетки цианобактерий. Состав среды, мМ: CaCl2 0,8; KH.I O iO,2; 0,5; MgS040,5; NaCl 0,1; ИдВОз 1; CuCl 1; CuS04 0,1; железо в виде этилендиаминтетраацетатного комплекса 50| NaiMuS04 0,2 мкМ, ZnS04 0,2 мкМ...

5

0

5

0

5

0

5

5

0

Получение гомогената листьев папоротника А. pinnata. .5 г азоллы без, корней (корни удаляют ножницами) растирают при 0-4 С в фарфоровой ступке в течение 15 мин в присутствии 10 мл раствора А: 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 8,5, содержащий 0,2 М хлористый натрий; 0,0005 М этилендиаминтетра- ацетат (ЭДТА), 0,01 М дитиотреитолj 0,01 М хлористый магнийi 2%-ный поливинил пирролидон. Полученный гомо- генат фильтруют через 8 слоев марли с ватой. Фильтрат центрифугируют 2 мин при TOOOg.

Получение бесклеточного экстракта листьев папоротника. Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования фильтрата, подвергают высокоскоростному центрифугированию (30 мин при 23000 g). Полученный надосадочный раствор (бесклеточный экстракт) содержит растворимые белки листьев папоротника ( мг). Для доказательства нативности белка используют тест на активность рибуло- зодифосфаткарбоксилазы (КФ 4.1.1.39)- фермента , который составляет около 50% от растворимых белков листьев растений. Исследованная в бесклеточном экстракте удельная активность этого фермента 0,23 ед/мг белка и сравнима с известной для других рас- тений.

Получение клеток цианобактерий. Осадок, получ енный после центрифугирования фильтрата при 1000 g в течение 2 мин, четыре раза промывают раствором А путем центрифугирования при 1000 g в течение 2 мин. Промытый осадок представляет собой клетки цианобактерий (-«50 мг). Осадок суспендируют в 5 мл раствора А.

Получение бесклеточного экстракта цианобактерий.. Суспензию цианобактерий растирают в фарфоровой ступке в течение 15 мин в присутствии мелкого .бесцветного кварцевого песка с размером песчинок 0,2-0,5 мм. Гомогенат центрифугируют 30 мин при 23000 g. Надосадочный раствор (бесклеточный экстракт), содержащий 7 мг растворимых белков, имеет характерный для цианобактерий .сине-зеленый .цвет. Для доказательства нативности белка используют тест на активность рибулозодифосфаткарбоксилазы. Величина удельной активности рибулозодифосфаткарбоксилазы, определенная в

5

бесклеточном экстракте симбиотичес- кой цианобактерии, 0,35 ед/мг белка и оказалась одного порядка с величиной удельной -активности этого фермента из клеток свободноживущих цианобактерии.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 ,однако растирани листьев папоротника в фарфоровой ступке.ведут менее 12 мин (10 мин), что приводит к снижению выхода растворимых белков листьев папоротника до 50 Ml . а также к снижению содержания растворимых белков цианобактерии до 5,0 мг.

Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, однако растирание листьев в фарфоровой стуке ведут более 15 мин (20 мин), что не приводит к дальнейшему повьшению выхода растворимых белков листьев папоротника и клеток цианобактерии. При растирании клеток цианобактерии с песком более 15 мин повышения выхода растворимых белков также не наблюдается, поэтому повышение времени растирания нецелесообразно.

Пример Л, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но при соотношении листьев папоротника и буферного раствора (вес/.объем) 1:5. Результаты аналогичны полученным в примере 1.

Прим ер 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но при весовом соотношении клеток цианобактерии и буферного раствора (вес/ /объем) 0,1:8. Результаты аналогичны полученным в примере 1.

П р и м е р 6. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но используют листья папоротника Azolla caroliniana. Результаты аналогичны полученным в примере 1.

Пример 7, Способ осуществляют согласно примеру 1, но используют листья папоротника Azolla fili- culoides. Результаты аналогичны полученным в примере 1.

10

15

20

15

25

30

35

40

5

0

1746

Таким образом, при точном соблюдении разработанных режимов предлагаемый способ позволяет обеспечить качественное разделение растворимых белков папоротника и цианобактерии из симбиогической системы Azolla-r Anabaena azolla, а также повысить выход целевого продукта как за счет полноты разделения тканей папоротника и цианобактерии, так и благодаря созданию условий для максимальных уровней экстракции белковых веществ.

Использование изобретения способ- . ствует развитию научных и прикладных работ, направленных на внедрение новой весьма перспективной сельскохозяйственной культуры,

Форму, ла изобретения

Способ раздельного получения бесклеточных экстрактов листьев папоротника и цианобактерии из симбиотической системы Azolla-Anabaena azolla, включаю1дий гомогенизацию растиранием в фарфоровой ступке растительного материала в буферном растворе, фильтрование гомогената, отделение клеток цианобактерии при помощи низкоскоростного центрифугирования с контролем результата осаждения, разрушение клеток цианобактерии с последующим центрифугированием гомогената, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества разделения и повьшения выхода растворимых белков, гомогенизацию листьев и цианобактерии ведут в течение 12-15 мин, разрушение осажденных клеток цианобактерии осуществляют путем растирания в ступке с кварцевым песком в буферном растворе при соотношении масса/ /объем 0,1:8-10, а гомогенат цианобактерии и полученный после низкосортного центрифугирования суперна- тант подвергают для удаления нерастворимой фракции центрифугированию.

Изобретение относится к биохимии растений, в частности к физико-химическим методам получения и анализа растительных белков, и может быть использовано в работах по изучению обмена веществ в симбиотической системе азолла - анабена, которые призваны обеспечить ускоренное внедрение этой перспективной культуры в народнохозяйственную практику. Целью изобретения является улучшение качества разделения и повышение выхода растворимых белков папоротника и цианобактерий. Основу предложенного способа составляет новая совокупность методических приемов, относящихся к режимам гомогенизации и фракционирования растительного материала. Способ предусматривает 6 основных стадий: 1) гомогенизацию листьев в фарфоровой ступке (12-15 мин при соотношении с буферным раствором 1:(2-5), 2)фильтрование гомогената, 3) низкоскоростное центрифугирование фильтрата (с микроскопическим контролем или при установленном на основании его результатов режиме- 2 мин при 1000G), 4) промывание осадка клеток центрифугированием в тех же условиях, 5) растирание клеток цианобактерий с кварцевым песком в фарфоровой ступке (12-15 мин при соотношении с буферным раствором 0,1:(8-10), 6) высокоскоростное центрифугирование гомогената цианобактерий и супернатанта после первого низкоскоростного центрифугирования. При точном соблюдении разработанных режимов новый метод обеспечивает получение из 5 г исходного материала 70 мг растворимых белков папоротника и 7 мг растворимых белков водоросли, характеризующихся высокими уровнями нативности и чистоты.