Способ получения ридулозодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы Советский патент 1979 года по МПК A61K38/45 C12N9/00 

3,Получение экстракта белка из выделенных хлоропластов после их разрушения.

4,Очистка фермента ий экстракт посредством Фракционирования сульфтом аммония, диализа и двухкратной хро.матографии на сефадексе G-.200.

Недостатком известного способа является невысокий выход целевого продукта. Процесс вьщеления рибулозодифосфаткарбоксилазы требует болшого количества листовой биомассы, мнЪгостадиен, сложен для воспроизвеяения техналогической стадии выдления хлоропластов. В результате пЬлучаюг фермент только лишь с карбоксилазной функцией и невысокой удельной активностью.

Целью опйсываолопо способа является разработка метода одновременного получений фермента с 2 каталитйческими функциями - рибулозодифосфаткарбоксилазной и рибулозодифосфатоксигеназной - в одном технолотич ескои процессе с повышенной активностью фермента и уве вггходоМ готового продукта из дешевого и доступного сырья - во;1оснеяа ситникового. Указанная цйяь достигается за счет того, чт для получения целев ого продукта исрользуют в ачестве сырья волосйец ситниковый, содержащий рибу лозодифосфаткарбсяссилазу-оксигенаjy, и предлагаемую ксгмбинацшо стадяй очистки рнбулозодифосфаткдрбокСйлазы-оксиген.азы в сочетании со следующими условия и проведения стадий очистки.

1. Гомогени-зацию сырья проводят в, буфере с рН 8-8,2,

2 . Очистка рибулозодифосфаткарбоксилаэы-оксигеназы осуществляется последов at стадийми:

а)гель-Фильтрацией экстракта из .ьев через сефадекс Q-50;

б)обработкой экстрецста сульфатом стрептомицина; в) фракционированием экстракта сульфатом аммония; г) обессоливанием на сефадексе д) гель-фильтраЦией на сефадёксе ,

Согласно изобретению описывается упрощенный процесс получения рибу 1озодифосфаткарбоксилазы-оксигназы (КФ 4.1.1.39) из автотрофных организмов с высоким выходом целевого продукта с двумя-каталитическими функциями из волоснеца (ломкс ошэсник) ситникового EEvmusCpsoith rostctctiNjs) junceus , заключающийся в получении гомогената из сырья в буфере с рН 8,0-8,2 и последующем выделении фермента последовательными стадиями: а) гельфильтращиёй экстракта на сефадексе .Q 50; б) обработкой сульфатом стрептомицина; в) фракционирование

сульфатом аммония; г) обессоливанием на сефадексе G-50; д) гельфильтрацией на сефадексе G-200,

Предпочтительно процесс проводят следующим образом;Все операции по очистке фермента проводят на холоду. Листья волоснеца ситникового гомогенизируют в буферной смеси следуквдего состава: трис-НСе 0,05 М, рН 8,0-8,2;

NaC 0,2 М; ЭДТА 0,005 М; MgCEj,0,01M; дитиотреитол 0,01 М, Гомогенат подвергают центрифугированию при 23000д в течение 30-40 мин. Далее с целью освобождения белка от низкомолетсул.ярнык примесей проводят гель-фильтрацию полученн-ого экстракта ч;ерез колонку с сефадексом Q-50, уравновешенную тем же буфером ./ в котором приводили гомогенизацию..ДаЛее, с

цвелью удаления нуклеин.ов:ьр |сислот, белковую фракцию обрабатыва от с;вежеприготовденным. 10%-нБМ ра твором ср льфата стрептодавйна который добавяЯЮт rip к агдаяНJI9 КСЙечнрй концентрации, 1,%.. р-дад к.удаляют центрифу1тар(5Вай;11(еФ1 и иЦцоЪадочн ую жидкость noiweprajpt,. ФР кйионйрованию сульфато.;аад«1Ь йИЯ;, Фракцйю, полученную в .x , центр фуг1 р;укй,...о 1аярк. ра лгворяют

в минймаяьном. колйчестде буфера следу щегр срстажа;: трис-нсе о ,025 м,

рН 8,0-8,2; WaCe 0,1 М; ЭДТА

0,0:05 М; Mg;ce.jj. о,аг м; ди;тй;отреитол о ,01 м. PactTSCip обесссхлявают на

колонке с сефадекайм; . , уравновешенной тем же .: стадию очистки цррврдда/посредством хроматографии обессиленной белковой фрикции на сефадексе ,,0-200, уравнрвешенном той ясе буферной системой, в которой проводят обе; ; Рй1вание. Фракции, содержащие фе1 ент, объединяют. Получают гомбгеннЫй препарат феЕмента, который можно хранить

в замороженном или лифилизованном сострянии,

Волоснец ситниковый вырац вают в оранжереена почве или в водной культуре на смеси Прянишникова ,

Навеску листьев (120 г) 3-недельных проростков волоснеца ситникового гомогенизируют в кратном объеме трис-НС -буфера (рН 8,1) низкой ионной силы (0,05 М), содержащего

0,2 М хлористый натрий, 0,005 М

ЭДТА, 0,01 М хлористый магний, 0,01 М дитиотреитол. . .

Полученную темно-зеленую массу фильтруют через полотно, затем центрифугируют в течение 40 мин при 23000q- , Для более полного вьщеления растворимых белков осадок два раза промывают исходным буфером. После первого промывания осадка дополнительно извлекают 5-6% белка. после.второго 1-2% белка от исходного,. НадОсадочную жидкость (экстракт из листьев), содержащую растворимы белки листа, далее подвергают очис ке от нйзкомолекулярных веществ не белковой природы путем фильтровани через колонку (100 х 4,0 см) с сефа дексом G-50, уравновешенную буфе ром, в котором проводят разрушение листьев. В результате фильтрации гомогената через сефадекс Q-50 выделяют два компонента. Все раство мые белки элюируются в составе первого компонента. Для удаления нуклеиновых кислот к белковой фракции, полученной посл«г фильтрования на сефадексе G-5C постепенно пэ каплям добавляют 10%-ный (свежеприготовленный) сульфат стрептомицина до конечной концентрации осадителя 1%. Сульфат стрептомицина готовят в буфере, который используют для получения экст ракта Из листьев волоснеца ситникового. Через 30 мин осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 16000 CJ-. . Осадок отбрасывают а иадосадочную жидкость используют для фракционирования белков сульфатом аммония. Перекристаллизованиый и растертый в порошок сульфат аммония добавляют к белковому раствору до 36% насыщения (количество сульфата аммоиия рассчитывают по номограмме), выдерживают 60 мин и центрифугируют 20 мин при 160009- . Далее таким же образом получают фракцию белка в пределах 36-44% насыщения и после цен-т эифугирования для . удаления сульфата аммония из ферментного препарата осадок белков растворяют в минимальном Объеме (2 мл) 0,025 М трис-нсе-буфера (рН 8,0), содержащего 0,1 М хлористый, натрий, 0,005 ЭДТА, 0,01 М хлористый магний, 0,01 дитиотреитол, и фильтруют через колонку (25 X 1,2 см) с сефадексом G-50, уравновешенную тем же буфером, со скоростью 0,1 мл/мин. Белковые фракции собирают. . Обессоленный на колонке с сефадексом Q-50 белковый раствор в количестве 3 мл (200 мг белка) наслаивают на колонку (100 х 2,2 см), с сефадексом G-200, уравновешенную тем же буфером, которым проводили обессоливание. Элюирование белков с колонки проводят со скоростью О,1 мл/мин. Фракции по 2 мл собирают при помощи автоматического коллектора фракций. Фракции 35-44 с ферментативной активностью объединяют. Фермент хранят при 0°С,-ил1Г в замороженном состоянии при -20с или высушивают лиофильно. Табл. 1 иллюстрирует описанный пример выделения фермента.. В табл. 2 дана характеристика ферментных препаратов в процессе хранения. . Свежеполученная рибулозодифосфаткарбоксилаза в 0,025 М трис-ЛСС-буфере (рН 8,0), содержащем 0,1 М хлористый натрий, 0,005 МЭДТА, 0,01 М хлористый магний и 0,01 дитиотреитол, была стабильна в течение недель при 0°С и при в течение 5-6 месяцев. Лиофильно высушенную рибулозодйфосфаткарбок- . ксилазу можно хранить при -20с в течение 6 месяцев, Рибулозодифосфатоксигеназа в 0,025 М трис-HCt-буфере (рН 8,0), содержа1дй«1 Q,l М хлористый натрий, 0,005 М ЭДТА, 0,01 М хлористый магний и 0,01 М дитиотреитол, при хранении в Течение полугода при -20°С теряет пй1 8оначальную активность. Однако нагр евание фермента в присутствии 50 мМ хлористого магния и 0,1 М дитиотрейтола при в течение 5.мин восстанавливает исходную активность. , Состав ферментной смеси для определения активности рибулозодифосфаткарбоксилазы (мкмоль/мл): хлористый магний 10,0; дитиотреитол 10,0; КаНС Oj 50,0 в 0,05 М трис-НС буфере (рН 8,1); рибулозо-1,5-дифосфат 0,5; рибулозодифосфаткарбоксилаза не более 0,05-0,1 мг белка. Контролем служит также реакцибййая смесь, но без рибуяозо-1,5-дифосфата. Состав ферментной смэсй Для otipeделения активности рибуМозгОди фосфатоксигеназы на полярог афе ЛП-7 (мкмоль/мл): хлористый магний дитиотреитол 0,4; рибулозо-1,5-дйфосфат 1,2; рибулозодйфосфатоксигеназа 0,71 мг; трис-НСе-буфер (рН 9,3-200,0). Одна единица рибулозодифосфаткарбоксилазы карбоксилирует 1 мкмоль рибулозодифосфата д6 2 мкмоль фосфоглнцёриновой кислоты при 30°С в 1 мин. Одна единица рибулозодифосфатоксигеназы оксигенирует 1 мкмоль рибулозодифосфата до 1 мкмоль фосфогликолята и 1 мкмоль фосфоглицерата при в 1 мин. Гомогенность выделенной рибулрзодифосфаткарбоксилазы-оксигеназы доказана следующими методами: 1) седиментационного равновесия на аналитической ультрацентрифуге spinco , модель Е; в малом слое с применением теневой оптики; 2) при электрофорезе в 7,5%-ном полиакриламидном геле; 3) с помощью электронной микроскопии негативно окрашенного препарата.

Т а «5 л и ц а

1210,3

1164,8 1005,2

398,4 32,95 0,160

100,0 96,21 83,09