Способ получения модифицирующих метилаз SSo @ И SSo @ Советский патент 1988 года по МПК C12N9/88 C12N9/88 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии и касается способа получения сайт-спеищфических метилаз,

Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса.

Способ предусматривает замену глицерина на тритон Х-100 повышающейся

конценурации при гидрофобной хромато- fo 22 и элюируется с колонки 0,43% триг афии на фенил-сефароэе, отбор ферментов из соответствую1цих пиков активности и исключение стадии изо- электрофокусирования.

Пример 1. Клетки Shigella sonnei 47 культивируют на бульоне Хоттингера с добавлением 20% глюкозы до достижения 10 млрд бактериальных тел в мл при 37°С. .Клетки осаждают

тоном Х-100, а метилазы Ssol - во фракциях градиента 25-37 и элюируется 0,52% тритоном Х-ТОО. Предлагаемый способ позволяет за 2 дня получит 15 ферменты с удельной активностью

7000 ед/мг белка. Ферментные препараты хранятся при -10°С в течение 12мес :(срок наблюдения) без потери активнос ти (см. табл. 2). При получении пре48 мл, объем одной фракции 1 мл. В градиенте обнаруживается два пика метилирующей активности SsoII и Ssol (см. фиг. 2 и табл. 1).

Для стандартной процедуры выделения фермента был выбран пример 2. Пик активности метилазы SsoII обнаруживается во фракциях градиента 16тоном Х-100, а метилазы Ssol - во фракциях градиента 25-37 и элюируется 0,52% тритоном Х-ТОО. Предлагаемый способ позволяет за 2 дня получить ферменты с удельной активностью

7000 ед/мг белка. Ферментные препараты хранятся при -10°С в течение 12мес :(срок наблюдения) без потери активности (см. табл. 2). При получении пре

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения сайт-специфических метилаз SsoII и Ssol. Изобретение позволяет получать из штамма Shigella sonnei 47 одновременно две модифицирующие, метилазы SsoII и Ssol, обладающий высокой стабильностью (более 12 мес). Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса. Способ предусматривает культивирование клеток Shigella sonnei 47, их разрушение ультразвуком, центрифугирование при 105000 g, освобождение от нуклеиновых кислот с помощью сульфата стрептомицина, высаливание белков сульфатом аммония (80% от насыщения) и проведение гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе с использованием комбинированного линейного градиента понижакнцейся концентрации сульфата аммония от 1,0 до 0,0 М и повышающейся концентрации тритона Х-100 от 0,30 до 0,60% и отбором фракций, соответствюущих для SsoII и для Ssol после хроматографии на фенил-сефарозе при концентрации тритона Х-100 соответственно 0,43 и 0,52%. 2 ил., 2 табл. iS (Л 4i 00 00 СО 4

центрифугированием. Затем клетки сус- 20паратов ферментов по прототипу метипендируют в рабочем буфере, рН 7,4,лазная активность сохранялась в тесодержащем 20 мМ калий фосфата, 7 мМчение 1-2 сут, активность составляла

й-меркаптоэтанола и 1 мМ ЭДТА, и раз-3000-4000 ед/мг белка, рушают на ультразвуковом дезинтегра- За единицу активности принимает

торе. Обломки клеток удаляют центри- 25количество фермента, необходимое для

фугированием, в течение 1 ч при .переноса Ipmol метильной группы S- 105000 g. Осадок oT6pacMBarot. Надоса-- дочная жидкость представляет собой грубый экстракт. Освобо;кдение от нукаденозилметионина на ДНК в течение 1 мин при 37°С,

Активность метилаз определяется

леиновых кислот проводят с помощью сульфата стрептомицина. Осаждение белков Проводят сульфатом аммония 80% от насыщения. Осадок растворяют в рабочем буфере, содержащем 1 М

30 с помощью радд1оизотопного метода. Инкубационная смесь объемом 50 мкл содержит 8-10 мкг белка, 5 мкг акцеп торной ДНК и 0,5 мкКи H-SAM. -Пробы инкубируют 1 ч при , наносят на

сульфата аммония и 0,3% тритона Х-ЮО фильтры GF/C, осаждают 20%-ной трии наносят в количестве 10 мг белка на колонку размером 170,7 см с фе- нил-сефарозой, уравновешенную тем же буфером. Колонку промывают тремя объемами буфера и ферменты элюируют двойнь1м линейным градиентом понижа.ю щейся концентрации сульфата аммония от 1 до 0,3 М и повышающейся концентрации тритона Х-100 от 0,30 до О,,45%.

хлоруксусной кислотой (ТХУ)5 отмьша- ют 5%-ного ТХУ к 70%-ным этанолом,

высушивают и помещают в толуоловый сцинтиллятор для подсчета радиоактив

40 ности.

I

Для идентификации модифицирующих

свойств ферментов реакцию метилирова ния проводят в инкубационной смеси

Объем градиента 48 мл. Объем собирае-.с объемом 100 мкл, содержащей 20 мкг

мой фракции 1 мл.

При этом пик активности метилазы Ssol отсутствует, что показано на . фиг. 1 и табл. 1,

Пример 2. Культивирование клеток, их разрушение, получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот и высаливание белков сульфатом аммония ведут как в примере 1. Белок, нанесенный на колонку с фенил-сефарозой, элюируют линейным градиентом концентра1 Д1и сульфата аммония от 1 до О М и тритона Х-100 от 0,30 до 0,60%. Объем .градиента

ДНК фага -Л , 35-40 мкг белка, 2 мкКи H-SAM, Пробы инкубируют 24 ч при .

Реакцию рестрикции проводят в инкубационной смеси объемом 50 мкл сле дующего состава: 0,1 М буфер, рН 7,4; 10 мМ MgCl, 1 каптоэтанола; 5-7 ед. активности рестриктазы; 1 мкг ДНК фага Д (используется метилированная ДНК). Инкубацию ведут при 37 С 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 50%- ного глицерина с 100 мМ ЭДТА и 0,5% бромфенолового синего. Рестриктазную

55

переноса Ipmol метильной группы S-

аденозилметионина на ДНК в течение 1 мин при 37°С,

Активность метилаз определяется

30 с помощью радд1оизотопного метода. Инкубационная смесь объемом 50 мкл содержит 8-10 мкг белка, 5 мкг акцепторной ДНК и 0,5 мкКи H-SAM. -Пробы инкубируют 1 ч при , наносят на

фильтры GF/C, осаждают 20%-ной трифильтры GF/C, осаждают 20%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ)5 отмьша- ют 5%-ного ТХУ к 70%-ным этанолом,

высушивают и помещают в толуоловый сцинтиллятор для подсчета радиоактивности.

I

Для идентификации модифицирующих

свойств ферментов реакцию метилирования проводят в инкубационной смеси

объемом 100 мкл, содержащей 20 мкг

ДНК фага -Л , 35-40 мкг белка, 2 мкКи H-SAM, Пробы инкубируют 24 ч при .

Реакцию рестрикции проводят в инкубационной смеси объемом 50 мкл сле- дующего состава: 0,1 М буфер, рН 7,4; 10 мМ MgCl, 1 мМ/ -мер- каптоэтанола; 5-7 ед. активности рестриктазы; 1 мкг ДНК фага Д (используется метилированная ДНК). Инкубацию ведут при 37 С 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 50%- ного глицерина с 100 мМ ЭДТА и 0,5% бромфенолового синего. Рестриктазную

активность тестируют с помсшью электрофореза в 0, агарозном геле. Гель окраЕшвают раствором этидий бромида Б концентрации 3 мкг/мп в течение 20 мни н фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 им с крас- светоф:-шьтром.

Препараты ферментов, полученные Цредложенным методом, не содержат экзо и эндонуклеаз, на что у1;азыва- ет полное сохранение ДНК фага Д при дхштельной инкубации (24 ч) избыточных количеств ферментов (10-20 ед,) в условиях, способствующих действию нуклеаз (в присутствии иопов ) , Это позволяет использовать мет илазы Зчо и SsoII в экспери.меитлк по мо-- леку. тярно- оно. гог ическсму конструированию рекоибниаи-Л1ых /l.ilK-in vitro.

Следует отметАгп уишсальиосл ь ме- тилазы ЗзоИ, котирую за счет вырожденности сайта узнавания ьгожио -ic пользовать а олько для ДНК ОТ соответс гнуюи:его TiiHa рестртпчациг но и от целог о ряда рестриктаз,, обладающих cxoд( caiiTaMii узг-шванпп не яесуиим вьп.южденности по цент- разплшй парс иуклеотидов.

Б предложенлюи методе сокращено число стадий ч время выделения фер- -5ентов SscJ.I и Ssol благодаря исключению из процесса очистки стадии

Таблица 1 Условия получения препаратов ферментов SsoII и Ssol

Концентрация сульфата аммония 1-0,3 М .

Концентрация тритона Х-100 0,30-0,45%

Концентрация сульфата аммония 1-0 М

Концентрация тритона Х-100 0,30-0,60%

изозлектрофокусирования. Способ может быть использован для получения метилаз SsoII и Ssol, необходимых для экспериментов и практических работ по генной инженерии.

Формула изобретен и я

Q Способ получения модифицирующих. метилаз SsoII и Ssol, предусматривающий культивирование клеток бактерий Shigella sonnei ГИСК ( 172, раз- рушение их ультразвуком, центрифуги5 рование, освобождение от нуклеиновых кислот сульфатом аммония и гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе :омбипироваипьм линейньш градиентом 1;он г«пюп1ейся концентрации сульфата

д а:. от 1 М до о М и повьш ающей- ся концентрацией элюента с элюцией SsoII концентрацией сульфата аммония 0,58 М, а Ssol - концентрацией сульфата аммония 0,37М, о тлич аю5 Щ и и с я тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, гидрофобную xpa ;aтoгpaфии на фенил-сефарозе ве- пуг с иснользовг1нием в качестве элюента повышающейся концентрации триQ тона Х-100 от 30 до 60 мас.%, при этом SsoII элюируют концентрацией , тритона Х-100 - 0,43 мас.%, а Ssol концентрациеГ тритона Х-100 - 0,52 мас.%.

Метилаза SsoII элюируется с 28 по 34 фр. - 0,4% тритоном Х-100

Пик активности метилазы Ssol отсутствует

Метилаза SsoII элюируется с 16 по 22 фр. - 0,43% тритоном Х-100

Метилаза Ssol элюирз ется с 25 по 37 фр. - 0,52% тритоном Х-100

Концентрация сульфата аммония 1-0 М

Концентрация тритона Х-100 0,30-0,65%

Активность в момент получения ферментов принята за 100%.

Продолжение табл.1

Метилаза SsoII элюируется с 16 по 22 фр. - 0,43% тритоном Х-100

Метилаза Ssol элюируется с 25 по 37 фр. - 0,52% тритоном Х-100

/

l/Mn// tJffSffOOmo

1000

w

fJflUMCfl

w

0

Фиг 1

40

ttd Nfp.

7030

fpue.2

UOffS