Способ выделения рестриктаз II класса Советский патент 1991 года по МПК C12N9/22 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения рестриктаз, которые используются для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.

Описаны рациональные методы очистки рестриктаз. Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения рестриктаз, предусматривающий фракционирование бесклеточных экстрактов при помощи фосфоцеллюлозы с последующей хроматографией на гидроксиаппатите.

Однако этот способ характеризуется низким выходом целевых ферментов: для рестриктаз I, Bam HI, Pst I, Sal I, Tag I он составляет 80, 1200, 600, 500 и 160 ед/г биомассы соответственно, что на порядок ниже соответствующих выходов этих ферментов, выделенных во ВНИИ прикладной энзммологии. Выделенные по известному

способу препараты рестриктаз не во всех случаях по своему качеству соответствуют мировым стандартам. Например, для достижения 90% легирования после обработки ДНК 50-кратным функциональным избытком рестриктазы Pst I (тест рестрикция - лигировйнке - рестрикция) обсуждаемую схему очистки (хроматография на фосфоцеллюлозе, гидроксиаппатите) необходимо дополнить хроматографией на гепа- ринсефарозе.

Как показывает опыт, в случае ряда рестриктаз нецелесообразно применять фосфоцеллюлозу для фракционирования бесклеточных экстрактов, так как значительная часть активности (или вся активность) рестриктазы оказывается в проскоке, что приводит к снижению выхода целевого фермента, и как следствие к снижению качества ферментного препарата.

о

NO

00

ю

00

ю

Целью изобретения является унификация способа.

Согласно предлагаемому способу выделение рестриктаз проводится по унифицированной схеме очистки: разрушение клеток ультразвуком, фракционирование бесклеточного экстракта на гепаринсефаро- зе с последующей хроматографией на фос- фоцеллюлозе и голубой сефарозе в 0,01 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4, 0,007 М 2-меркаптоэтанол, 0,001 М ЭДТАс элюцией фермента с колонки градиентом NaCI 0,1- 0,8 М при хроматографии на гепаринсефа- розе и фосфоцеллюлозе и 0,01-0,1 М при хроматографии на голубой сефарозе.

П р и м е р 1. Получение рестриктаз ХЬа I, Есо 147 I (изошизомер Stul) и Notl.

Последовательность операций следующая: разрушение клеток, хроматография на гепаринсефарозе, хроматография на фосфоцеллюлозе, хроматография на голубой сефарозе,

Для выделения и очистки рестриктаз используют следующую аппаратуру: ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т, центрифугу Бекман Ж-21, холодильный шкаф МиниколдЛаб, хроматографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питания УИП-1. Сорбенты: фосфоцеллюлоза, гепаринсефа- роза и голубая сефароза.

ДНК фага А и плазмиды рСЕЗ выделены по известной методике.

При разрушении клеток и хроматографии используют 0,01 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,007 М 2-меркаптоэтанол, 0,001 М ЭДТА (буфер А).

Активность рестриктаз тестируют мето- дом гидролиза ДНК фага А и плазмиды рСЕЗ с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в ага- розном геле. Реакционная смесь для гидролиза содержит: 0,01 М трис-HCl, рН 7,8, 0,005 М MgCh, 0,15 М NaCI, 100 мкг/мл альбумина (для рестриктаз Nat InXba I), 0,01 М трис-HCl, рН 8,0, 0,005 М MgCb, 0,025 М NaCI (для рестриктазы Есо 147 I).

В реакционную смесь входит ДНК фага А (в случае рестриктаз ХЬа I и Есо 147 I) или ДНК плазмиды рСЕЗ (рестриктаза Not I) Концентрация ДНК составляет 50 мкг/мл. В пробу объемом 40 мкл вносят 1-5 мкл соответствующего ферментного препарата и реакцию проводят 1 ч при 37°С. Электрофорез проводят в 0,1 М натрий-боратном буфере, рН 8,2, 0,002 М ЭДТА в течение 1 ч при напряжении 100 В. Окрашенные этидий бромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ-свете.

За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДРК фаза А,

Все операции по выделению и очистке

ферментов проводят при +4°С.

Для выделения рестриктаз Xba I, Not, Есо 1-47 I используют биомассы клеток Xanthomonas badrlS, Nocardla otitldisca0 vlarurn и Escherlchia coll RFL 147 соответственно.

Разрушение клеток: 20 г биомассы клеток суспендируют в 40 мл буфера А, содержащего 0.1 М NaQ, обрабатывают ультразвуком

5 на дезинтеграторе мощностью 100 W в течение 7 мин и центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж-21 С, ротор ЖА-20.

Хроматография на гепаринсефарозе.

0 Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5x20 см с гепаринсефарозой, уравновешенной буфером А, содержащим 0,1 М NaCI. Колонку промывают 60 мл того

5 же буфера и элюируют линейно повышающейся концентрацией NaCI 0,1-0,8 М в 500 мл буфера А. Фракции, содержащие основную часть активности, объединяют и диализу ют в течение 16 ч против 2 л буфера А,

0 содержащего 0,1 М NaCI.

Хроматография, на фосфоцеллюлозе.

Ферментный раствор после диализа со ско- ростью 20 мл/ч наносят на колонку (1,5 х

хЮ см) с фосфоцеллюлозой, уравновешен5 ной буфером А, содержащим 0,1 М NaCI. Колонку промывают 20 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом концентрации NaCI 0,1-0,8 М в 250 мл буфера А. Фракции, содержащие основную часть ре0 стриктазной активности, объединяют и ди- ализуют в течение 16ч против 1 л буфера А, содержащего 0,1 М NaCI,

Хроматография на голубой сефарозе. Ферментный раствор после диализа со

5 скоростью 10 мл/ч наносят на колонку (1 х хЮ см) с голубой сефарозой, уравновешенной буфером А, содержащим 0,1 М NaCI. Колонку промывают 10 мл этого же буфера и элюируют линейным градиентом

0 концентрации NaCI 0,1-1,0 М в 100 мл буфера А, Фракции, содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют, добавляют альбумин до концентрации 50 мкг/мл и диализируют против 0,01 М

5 трис-HCl буфера, рН 7,4, содержащего 0,05 М KCI, 0,0001 М ЭДТА, 0,001 М дитиотрей; тола и 50% глицерина (по Ьбъему), в случае рестриктаз ХЬа I и Not I. Для рестриктазы Есо 147 I используют 0,01 М трис-HCl буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М KCI, 0,001 М ЭДТА, 0,001 М дитиотрейтол и 50% глицерин (по объему). Ферментные препараты хранят при -20°С.

Из 1 г сырой биомассы получают 10000, 200, 30000 ед. активности реориктаз ХЬа I, Not I и Есо 147 I соответственно.

П р и м е р 2. Определение качества ферментных препаратов рестриктаз.

Качество рестриктаз определяют двумя тестами: общей оценкой нуклеаз и методом рестрикция - лигирование - рестрикция.

При проведении общей оценки нуклеаз в пробирки, содержащие по 2 мкг ДНК в 40 мкл стандартной для данной рестрикта- зы реакционной смеси, вносят различные количества исследуемого препарата и инкубируют 16 ч при 37°С. Продукты реакции анализируют методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. При увеличении избытка ферментов до 15-кратного при продолжительности инкубации 16 ч не наблюдается снижения интенсивности и четкости зон в электрофореграмме, что указывает на отсутствие неспецифических нуклеаз в ферментных препаратах.

Для оценки качества рестриктаз при помощи метода рестрикция - лигирование - рестрикция в пробирки, содержащие 6 мкг ДНК в 40 мкл стандартной для исследуемой рестриктазы реакционной смеси, добавляют различные количества препарата рестриктазы и инкубируют 16 ч при 37°С Реакцию останавливают, помещая пробы в 65°С на 10 мин. Состав реакционной смеси коррегируют соответствующими добавками, чтобы его приблизить к оптимальному для лигирования (0,05 Мтрис-HCI буфер, рН

7,6,0,0 1 М MgCl2, 0,01 М дитиотрейтол, 0,07 мМ АТФ), добавляют ДНК лигазу и инкубируют 16 ч при 12°С.

Повторное расщепление проводят ин- 5 кубацией при 37°С в течение 1 ч, для чего используют двухкратный избыток соответствующей рестриктазы. Продукты реакций расщепления субстрата, лигирования и повторной рестрикции лигатов анализируют 0 методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Лигирование рестриктов и повторное расщепление лигатов происходит полностью и не зависит от избытка рестриктаз в отношении субстрата (до 50- кратного 6 функционального избытка).

Следовательно, препараты рестриктаз Xba I, Not I и Есо 147 I не содержат примесей неспецифических нуклеаэ и фосфотаз и могут успешно испбльзоваться в работах по 0 генной инженерии.

П р и м е р 3. Согласно предлагаемому способу возможно также выделение других рестриктаз I класса (см. таблицу).

Указанные в таблице микроорганизмы 5 хранятся во ВНИИ генетика, Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов. .

Формула изобретения Способ выделения рестриктаз II класса, 0 включающий гомогенизацию сырья, экстракцию гомогената и хроматографическую очистку экстракта, отличающийся тем, что, с целью унификации способа, хроматографическую очистку выполняют последова- 5 тельно на гепаринсефарозе в градиенте NaCI, на фосфоцелллюлозе в градиенте NaCI и на голубой сефарозе в градиенте NaCI 0,09-0,11 до 0,98-1,02 М.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения ресгриктаз. Рестрикта- зы используются для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Целью изобретения является унификация способа. Способ заключается в том, что выделение рестриктаз проводится по унифицированной схеме очистки: разрушение клеток ультразвуком, функционирование экстракта на гепарин-сефэрозе, хроматография на фосфоцеллюлозе и голубой сефа- розе. Способ апробирован на примере выделения рестриктаз Xba I, Not I, Eco 1471, Alw 261, Alw 441, Bsp 501, Eel 13611, Eco81l, Kpn i, Kpn 21. Рае I 1 табл.