Способ выделения ДНК-полимеразы TRU из биомассы бактерий микроорганизма JнеRмUS RUвеR ВКМ 1258 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/12 C12N9/12 C12R1/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии, касается выделения фермента ДНК-полимеразы и может быть использовано в генной инженерии.

Цель изобретения - упрощение процесса, увеличение удельной активности и выхода фермента.

Способ заключается в культивировании штамма бактерий рода Thermus ruber BKM 1258 на жидкой питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы при 55-70°С с последующим выделением и очисткой целевого фермента колоночной хроматографией при линейном градиенте 0-0,8 М NaC последовательно на КМ-Тоеперле, ДЭАЭ-Тоеперле и геларин- сефарозе.

Пример, Для осуществления роста культуры Thermus ruber BKM 1258 подготавливают питательную среду, содержащую в 1

л: 200 г картофельного отвара, 5 г пептона и 1 г дрожжевого экстракта, остальное водопроводная вода (рН среды 8,0) Рост производят при 60°С в качалочных колбах объемом 2 л, 120-150 об/мин в течение 16 ч до поздней логарифмической фазы. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин с 6000 g в течение 10 мин с 1 л среды 7 г биомассы. Суспендируют в буфере ЕВ следующего состава: 10 мМ трис-НС, рН 7,5, 5 мМ 2-меркатозтанол. 0,5 мМ ЭДТА. 0,4 М NaCI, 25 мкг/мл PMSF (фенилметил- сульфонилфторид) Разрушают клетки ультразвуком (22 кГц 10 раз по 1 мин мощность тока 100 мА).

Центрифугируют при 40000 об/мин 1,5ч с 105000 g, Супернатант разбавляют в два раза 10 мМ трис-HCI рН 7,5 и осаждают белок ( в интервале 35-75% насыщения за 30 мин при t 4°C, центрифугируют 20 мин 15000 об/мин с 20000 g Осадок

VJ

О

Ю

ы

растворяют в буфере А, содержащем 10 мМ К-фосфатз рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-мер- каптоэтанола, диализуют против этого же буфера (12 ч) и наносят на колонку с КМ (карбоксиметил)-Тоеперлом.

Элюируют буфером А. Белок, не связавшийся с сорбентом, собирают при помощи спектрофотометра при длине волны 280 нм.

Эту фракцию диализуют против буфера В, содержащего 10 мМ трис-HCI рН 7,5; 0,5 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, и наносят на колонку с ДЭАЭ-Тоеперлом 650 моль. Элюируют 0-0,6 моля KCI (линейный градиент). Тестирование ДНК-полимеразной активности выделенного фермента на матрицах ДНК-типа проводят в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей: 25 мМ трис- HCI рН 9,0, 15 мМ KCI, 5 мМ MgClz, 1 мМ 2-меркалтоэтанола, 10 нмоль d NTP (1 мк Ки 3Н ciGTP) и 140 мкг/мл активированной ДНК. Тестирование проводят при 70°С в течение 30 мин.

За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует включение 10 нмоля предшественников в кислотонераствори- мый продукт на 30 мин в стандартных условиях инкубации.

Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера В на колонку с гепарин-сафа- розой 4В, Элюируют линейным градиентом 0-0,8 NaCI.

Фракции тестируют так же, как и после колонки с ДЭАЭ-Тоеперлом. Активные фракции объединяют и диализуют против буфера С, содержащего 10 мМ Трис-HCf рН 7,5, 100 мМ KCI, 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 50% глицерина, до концентрации 1 ед.акт/мкл, и хранят при 20°С.

Полученный фермент ДНК-полимеразы Тги и имеет следующую характеристику: молекулярная масса70000 дальтон (+1,5%); рН

0

5

0

оптимум 9,0 ± 1,0; рН стабильность 7,5-12,0 (при рН 6,5 активность менее 5% от максимальной).

Ингибиторы фермента: полиамины (спермин-20 мМ, спермидин 100 мМ, алкалоид кураре 20, фторид натрия NaF 50 мМ).

Фермент проявляет резистентность к SH-реагентам.

Температурный режим 50-80°С. Температурный оптимум 68-70°С. Термостабильность: 90% исходной активности после двухчасовой преинкубации при 70°С,

Оптимум моновалентных катионов: Na4 и К+0.015М.

tj ,

Оптимум дивалентных катионов: Мд и Мп2+ и 0,15 мМ соответственно.

Изоэлектрическая точка: 8,2 ±0,1 (изо- электрофокусировка).

Константа Михаэлиса: для UNTP 63 мкМ.

Фермент не содержит эндо- и экзонук- леазных активностей.

Степень очистки ДНК-полимерэзы Тги составляет 1180 раз, выход по активности 5 66,6%, а получаемая удельная активность 22000 ед акт/мг белка.

Формула и з обретения Способ выделения ДНК-полимеразы

0 Тги из биомассы бактерий микроорганизмов Thermos ruber BKM 1258, предусматривающий разрушение клеток ультразвуком, отделение дебриса ультрацентрифугированием, фракционирование сульфатом аммо5 ния в интервале 35-75% насыщения и колоночную хроматографию в линейном градиенте NaCI 0-0,8 моль, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения удельной активности и выхода

0 фермента, колоночную хроматографию осуществляют последовательно на КМ-Тоепер- ле, ДЭАЭ-Тоеперле и гепарин-сефарозе

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии. Цель изобретения-упрощение процесса, увеличение удепьной активности и выхода фермента. Способ заключается в получении биомассы Thermus ruber BKM 1258, разрушении клеток ультразвуком, отделении дебриса ультрацентрифугированием, фракционировании сульфатом аммония в интервале 35-75% насыщения и колоночной хроматографии, осуществляемой последовательно на КМ-Тоеперле, ДЭАЭ-Тоеперле и ге- парин-сефарозе в линейном градиенте NaCI 0-0,8 моль. Степень очистки ДНК-полимера- зыТги 11800 раз, выход по активности 66,6%, удельная активность 22000 ед/мг белка.