Способ определения гликопротеидов и белков сыворотки крови Советский патент 1993 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано при клинико-биохимическом обследовании больных и экспериментальных исследованиях.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа определения гликоп- ротеидов и белков сыворотки крови.

Способ осуществляется следующим образом.

Растворы реактивов готовят заранее, согласно прописи (табл. 1) и хранят в холодильнике. Все реактивы приготавливают на деионизированной воде.

Готовят раствор разделяющего геля, хорошо смешивая 1 ч. раствора № 1, 2 ч. раствора № 2, 1 ч. деионизированной воды, 4 ч. раствора № 3. Под контролем рН-метра доводили рН раствора до 8,6 с помощью HCI.

Электродный буфер готовят из расчета на 1000 мл раствора по прописи. Перед употреблением исходный раствор буфера разводят всего в три раза.

Стеклянные трубочки (100 мл х 6 мм) фиксируют в штативе, обеспечивающим

строго горизонтальный уровень и заполняют раствором разделяющего геля с помощью шприца до 2/3 объема. Оставшийся объем заполняют водой. Наслаивание воды проводят осторожно с помощью шприца с катетером. Конец полимеризации отмечается по истечении 20-40 мин по образованию четкой горизонтальной границы между водой и гелем. Наслоенную жидкость отсасывают с помощью шприца с катетером. Непосредственно на гель наносят 5 мкл нативной сыворотки автоматической микропипеткой. Сверху наслаивают раствор электродного буфера, разбавленного в три раза, поскольку эта часть гелевой колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером. Добавляют 3-5 мкл метчика - бромфенолового синего.

Время электрофоретического разделения 50-60 минут, сила тока 3 мА на одну трубочку. В течение всего периода электрофореза создают дополнительное охлаждение с помощью термостатического циркулятора Malti Temp системы Multi Pgor 1KB, Швеция, для исключения влияния

СП

оо ю VI о

СА)

сл

образующего тепла на ход электрофореза в ПААГ.

Окончание электрофореза констатируется при достижении метчика - бромфеноло- вого синего анодного конца гелевой колонки. После проведения электрофореза гелевые трубочки удаляют обводкой стальной иглы под слоем деионизированной воды. Фиксацию белков в гелевой колонке проводят 10%-ным раствором трихлорук- сусной кислоты в течение 30 мин и окраши- вают 0,2%-ным раствором Coomassi Brilliant Blu R-250, лишнюю краску отмывали смесью этанол-вода-уксусная кислота, Для выявления гликопротеинов использовали методику Колдуэлла и Пигмана (May- pep). Гели выдерживают в 7,5% уксусной кислоте в течение часа, затем 1 ч в 0,2% раствора йодной кислоты при 0-4°С. Посяе многократного отмывания 15%-ной уксусной кислотой гели инкубируют с реактивом Шиффа при 0-4 °С и промывают в 7,5% уксусной кислоте до полного удаления красителя из геля. С помощью применения таких методических приемов, упрощающих процесс электрофореза, получают стандартные фореграммы с 17-21 Шифф-позитив- ными и белковыми фракциями. Качественную характеристику гликопротеи- новых и белковых фракций проводят по их электрофоретической подвижности относительно движения трансферина. Идентификация отдельных белковых фракций производится на нефиксированных гелях путем их погружения в соответствующие красители. Церулоплазмин устанавливается окраской парафинелендиамином, полосы гаптоглобинов выявляются по пероксидазной активности, скрашиванием бензидином с перекисью водорода, транс- ферин по методике Clark, Annals (Maypep), у-глобулины, по окраске с лактофлавином. Использовали такие стандарты белков. Таким образом, комплекс примененных методов идентификации позволяет выделить зоны и фракции представленные в таблице.

Учитывая разную частоту встречаемости отдельных фракций и их электрофорети- ческую подвижность, мы сочли возможным разделения гликопротеинов и белков по зонам.

При разграничении денситограммы на зоны используются в качестве визуальных ориентиров пики, которые отчетливо выявляются как на протеинограмме, так и на гликопротеинограмме.

Графическая запись полученных форег- рамм проводилась на денситометре фирмы Instrumental laboratory США. Гели сканируют при длине волны 575 нм для гликопро0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

теинов и 600 нм для белков. Количественное содержание белковых и гликопротеиновых фракций выражали в относительных процентах, вычисляя путем просчета площади треугольника, поскольку он дает более правильные результаты.

П р и м е р. У крысы линии Л/ад, находящейся на сбалансированном полусинтетическом рационе, взята декапитацией кровь и по указанной методике из сыворотки крови выделены гликопротеины и белки и определены количественно в относительных процентах. Содержание гликопротеинов в сыворотке крови у данного животного составило: од-макроглобулиновая I зона - 4,70%, гаптоглобиновая II зона - 17,65%, гаптоглобиновая III зона - 7,06%, гаптоглобиновая IVзона-9,41%, гаптоглобиновая V

-14,12%; зона VI а2 Н5-гликопротеина - 5,88% церулоплазминовая VII - 3,53%, трансфериновая VIII -4,70%; а -кислого глобулина IX зона - 3,53% антитрипси- новая Х-7,06%, альбуминовая XI - 17,64% преальбуминовая XII - 1,18%.

Содержание белков электрофоретиче- ских зон составило: а. 2-макроглобуиновая I

-5,70%, гаптоглобиновая II - 13,79%, гаптоглобиновая III -6,90%, IV -9,10%, V зоны 10,3%, преальбуминовая - 2,30%.

Снизив рН гелевого буфера до 8,6 и используя концентрированный (в 3 раза) раствор электродного буфера с рН 8,6, мы достигли того, что микроколичество 5 мкл белков нативной сыворотки концентрируется в тонкую стартовую зону, которая принимает форму диска, т.е. отпадает необходимость дополнительной концентрации образца в отличие от прототипа. Это дает возможность снизить расход времени электрофореза, исключая таким образом, отрицательное влияние диффузии, возникающем при длительном электрофорезе. При этом дополнительное постоянное непосредственное охлаждение электрофоретической системыспомощью термостатического циркулятора позволяет исключить перегревание геля в ходе электрофореза и помогает качественному разделению фракций. При помощи концентрированного в три раза буфера удается получить более четкое разделение и большее число фракций, чем используя способ прототипа, что имеет принципиальное значение, а также возможность получить стандартные электрофореграммы.

Таким образом, способ определения гликопротеинов и белков в сыворотке крови позволяет получить стандартные фореграммы с неперекрывающими фракциями.

Предложенный способ дает точное, упрощенное и быстрое электрофоретическое разделение гликопротеинов и белков и требует микроколичеств биоматериала (натив- ной сыворотки) по сравнению с известным способом.

Способ технически прост в использовании и позволяет в 2 раза сократить рабочее время, основан на использовании доступных химреактивов в меньших количествах, что удешевляет его по сравнению с прототипом.

Реактивы для электрофореза гликопротеинов и белков в полиакриламидном геле приведены ниже.

Растворы разделяющего геля на 100 мл

№1 1 н. HCI-48,00 мл

ТРИС-36,6грН 8,6

№ 2 Акриламид - 0,23 г

№3 МБА-0,8г

ПСА-0,14 г

Растворы электродного буфера на 1000мл

ТРИС-6,0 г Глицин-28,8 грН 8,6 Перед употреблением разводится в 3 раза.

Формула изобретения Способ определения гликопротеидов и белков сыворотки крови, включающий получение сыворотки крови с последующим про- ведением электрофореза в ПААГ с использованием концентрирующего и разделяющего гелей, при этом электрофорез проводят при постоянном охлаждении при напряжении 200 В и силе тока 3 мА, подава- емых на трубку, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, пробу нативной сыворотки в объеме 5 мкл наносят на разделяющий гель, а разделение проводят с помощью 0,05 М трис-гли- цинового буфера, предварительно разбавленного деионизированной водой в 3 раза.

Использование: медицина, клиническая и экспериментальная биохимия. Цель - ускорение и упрощение способа. Сущность изобретения: берут пробу нативной сыворотки в объеме 5 мкл, наносят ее на разделяющий гель, при этом разделение проводят с помощью 0,05 М трис-глицино- вого буфера, предварительно разбавленного депонизированной водой в 3 раза, электрофорез проводят при постоянном охлаждении при напряжении 200 В и силетока 3 мА, подаваемым на трубку. Использование способа в 2 раза ускоряет время исследования. 1 табл.