Способ обработки электрофореграмм Советский патент 1991 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится У биохимии и химии и может использоваться в биохимических, клинико-биохимических химических исследованиях, в химической, пищевой, парфюмерной, химике -Фармацевтической отраслях промышленности, при биогехно- логических производствах, во всех случаях где необходимо применение методов разделения посредгтвом электрофореза в гелях

Целью является повышение точности определения при одновременной экономим реактивов.

На фиг 1 и 2 представлены фотопроекции окрашенных гелевых электрофореграмм

Время выдержки фиг 1-16 (А), 20 (Б) и 34 3 или ЗЬ (В) ч, фиг 2 - 16 (А), 12 (Б) и 26,8 (В; ч

Способ может быть осуществлен следующим образом

Для каждой системы с ее особенностями (свойства и размеры геля, особенности и количество фракционируемого материала, характер и концентрация красителя и т п ) предварительно определяют минимально

необходимое время инкубации (прокрашивания) разогнанных электрофореграмм в данном растворе красителя. Для этого две электрофореграммы с расфракционирован- ным материалом, представляющие собой гелевые столбики (ГЭт и ГЭ2), выдерживают в растворе красителя в течение времени, соответственно ti и г (причем ц 12, например t2 1,2 - 1.25ti, и наоборот). Затем ГЭт и ГЭг отмывают обычным способом от излишков красителя (в местах, свободных от фракционируемого материала) и фотографируют. На полученных фотопроекциях (фиг. 1 и 2 А и Б) с помощью палетки со стороной квадрата в 1 мм, определяют площади неокрашенных зон по внешней границе замкнутой кольцевой (овальной или грушеобразной) зоны 1, ограниченной усиленно окрашенным контуром (соответственно Si и 82) По площади указанных зон и соответствующему им времени выдержки ГЭ в растворе красителя (соответственно ti nt2J рассчитывают минимально необходимое время (Тмин) для полного прокрашивания ГЭ в конкретных условиях по формуле

Тмин - :;;j;

Si -82

Пример. Все использованные в эксперименте гелевые электрофореграммы (ГЭ) представляли собой столбики 15%-но- го полиакриламидного геля (содержащего 2.5 М мочевины) высотой 100 мм и диаметром 6 мм. В каждом столбике предварительно было осуществлено с помощью электрофореза (в идентичных условиях) фракционирование 40 мкг тотального препарата гистонов тимуса теленка. Фракционирование осуществляли в течение 2,5 ч при силе тока 1,8-2 мА с использованием модели прибора 73 для электрофореза фирмы Реанал (Венгрия), а в качестве электродного буфера - 0,9 М раствора уксусной кислоты (рН 3,2).

Каждую из полученных описанным способом ГЭ помещали для окрашивания в 10 мл 0,05%-ного раствора Кумасси бриллиантового синего, растворенного в смеси изопропанола и 0,9 М уксусной кислоты (в объемном соотношении 1:3).

Две идентичные гелевые электрофореграммы - ГЭ1 и ГЭ2 выдерживали в растворе красителя соответственно 16 и 20 ч, где 16 ч - время ti. a 20 ч - время t2. Таким образом, ti 16 ч - это время, рекомендованное литературой, a t2 составляет 1,25ti. Затем ГЭГи ГЭ2 отмывали обычным путем от излишков красителя (в 0.9 М уксусной кислоты). Полученные ГЭт и ГЭ2 имели вид,

0

5

представленный соответственно на фиг. 1А и 1Б. ГЭ1 и ГЭ2 фотографировали и на их фотопроекциях определяли соответственно Si и S2 - площади тех зон расфракциониро- ванного гистонового материала, которые ограничены контуром наиболее интенсивной окраски, включая площади полосок собственно контура, обозначенных стрелками на фиг. 1А и 1 Б. При измерении площадей (Si и 82) пользовались палеткой со сто юной квадрата 1 мм. Минимально необходимое время прокрашивания ГЭ-м рассчитывали по формуле:

Sit2- S2ti

1мин

Si-S2

- 64,0мм2 х 20ч - 50,0мм2 х 16ч 34 3 64,0мм2 - 50.0мм2

После УГОГО осуществляли прокрашивание ГЭ в избранных условиях с учетом того, что, минимально необходимое время про- гкрашивания составляло 34,3 ч. Полученные таким образом ГЭ имели вид, представленный на фиг. 1В (т. е. были полностью прокрашены).

На таких электрофореграммах разделение компонентов гистонового материала было четко видно и было представлено четырьмя основными фракциями, отсутствовала неравномерность окрашивания, в том числе и за счет исчезновения контурных границ.

Способ позволяет варьировать условия

окрашивания электрофореграмм в зависимости от особенностей эксперимента (характер геля, фракционируемого материала, красителя, и т. д.) и позволяет сделать выбор между экономией красителя за счет увеличения длительности прокрашивания или экономией времени за счет повышения концентрации красителя в окрашивающем растворе. Таким образом, предлагаемый способ гарантир/ет правильность выявления фракций электрифоретически разделяемого материала за счет обеспечения полноты их окрашивания.

Формула изобретения Способ обработки электрофореграмм путем их окрашивания, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности определения при одновременной экономии реактивов, окрашивают две одинаковые гелевые электрофореграммы в одинаковых условиях при разной выдержке в растворе красителя, фотографируют отмытые гелевые электрофореграммы, на полученных фотопроекциях измеряют площади зон. ограниченные контуром наиболее

интенсивной олраски. и минимально необходимое время прокрашивания рассчитывают по формуле

Slt2-S2t1

1мин Si-S2

где Si и S2 - площади зон, ограниченных контуром наиболее интенсивной окраски. на фотопроекциях гелевых электрофоре- грамм при выдержке в красителе соответственно ti и t2.

Изобретение относится к биохимии и химии, может использоваться в биохимических, клинико-биохимических и химических исследованиях, когда необходимо применение методов разделения посредтвом электрофореза в гелях. Цель изобретения заключается в повышении точности определения электрофоретических разделяемых компонентов Цель достигается благодаря точности предварительного определения минимально необходимого времени прокрашивания гелевых электрофореграмм, обеспрчивающего обязательное полное окрашивание этих электрофореграмм путем прокрашивания одинаковых гелевых электрофореграмм в одинаковых условиях при разных выдержках (ti и 12) фотографирование гелевых электрофореграмм измерение на полученных фотопроекциях площадей($1 и 82) зон, ограниченных контуром наиболее интенсивной окраски, и определение минимально необходимого времени прокрашивания по формуле 1Мин (Sit2 -S2n)/(Si - 82) Способ позволяет точно определить количество и соотношение разделенных электрофорезом фракций, минимально необходимое время полного прокрашивания электрофореграмм, предотвращает излишние расходы реактивов и рабочего времени, позволяет варьировать условия окрашивания электрофореграмм 2 ил Р и L

| /, i-X.

т т

Jb-Щ Ж

А Б Фиг. I

А Б В Фиг. 2

В

Ј5