Способ получения антигена аденовирусов крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12N5/02 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается получения антигенов аденовирусов крупного рогатого скота, необходимых для создания вакцин, диаг- ностикумов и других биологических препаратов, а также для проведения научно-исследовательских работ.

Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта.

Пример 1. Получение антиге- на аденовируса КРС II подгруппы (7-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Тау- рус-1, выращенных в стационарных матрасных колбах.

В 1,5-литровую матрасную колбу с клетками линии Таурус-1 на уровне 110 пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретого до 37°С, Через 10-15 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37°С на 2-3 мин. Затем вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла После этого в клеточную взвесь добавляют среду роста - Игла MEM с 10% сыворотки крупного рогато- то скота (СКРС) и разливают на две 1,5-литровые матрасные колбы,

Эти культуры III пассажа инкубируют при 37°С в течение 3 сут до момен« 1

СО

15

20

25

та формирования плотного монослоя. При заражении вирусом среду из куль- туральных сосудов сливают, клетки однократно промывают питательной ере- с дои и вводят 0,1 ТЦЦ5о/клетку. Используют штамм вируса Русь 18/81 на уровне 10 пассажа на культуре клеток тестикул бычка после проведения его через организм теленка. Адсорбцию ви- Q руса проводят в термостате при 36°С в течение 90 мин. Затем добавляют 200 мл поддерживающей среды - Игла MEM без СКПС с добавками 0,03% глю- тамина и 0,04% аргинина. Культуры ежедневно просматривают под малым . увеличением микроскопа На вторые сутки примерно 40-50% клеток подвергаются специфической дегенерации, на третьи сутки в процесс вовлекаются практически все клетки. Титр аденовируса равен 7,0 lg ТЦД50/мп. В параллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка титр вируса равен 4 lg ТЦЦ5о/мл.

П р и м е р 2. Получение антигена аденовируса КРС II подгруппы (7-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Тау- рус-1, выращенных в роллерах.

В 1-литровый роллерный флакон с клетками линии Таурус-1 вводят взвесь клеток III пассажа, полученную из 1,5-литровой матрасной колбы в объеме 100 мл. Далее культуры готовят по примеру 1. Флакон с клетками помещают в роллерную установку с режимом вращения 20 об./ч. Заражение культур проводят во примеру 1 с множественностью 0,2 Т1Щ50/клетку, а сбор вируса осуществляют через 48 ч после заражения. Титр вируса 7,75 lg , В параллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка титр 5,5 lg ТЦЦ50/мл.

П р и м е р 3. Получение антигена аденовируса КРС II подгруппы (7-й серотип) проводят по линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-1, выращенных на микроносителях.

В 1-литровую колбу вносят 100х 10Й клеток 115 пассажа, взвешенных в 250 мл среды Игла MEM с 10% СКРС и 5 мл микроносителя Цитолар-1, содержание примерно 40 тыс, частиц диаметром 230-250 мк.

Адсорбцию клеток на МН проводят в течение 24 ч при 35°С, затем включают магнитную мешалку со скоростью

вируса проводят в течение 1 ч 37°С. После этого вносят до

16329734

22 об./мин. На следующие сутки добавляют 250 мл свежей питательной среды того же состава. Через 72 ч после формирования монослоя на МН, среду роста удаляют, а на клетки вносят 10 мл вирусосодержащей суспензии с титром 4,75 lg . Адсорбциюпри

500 мл поддерживающей среды, указанного в примере 1 состава. Перед заражением определяют количество клеток в колбе, В данном случае оно было 300-10б.

Полная дегенерация клеток на МН зарегистрирована на третьи сутки, когда и производят сбор вируса. Титр вируса равен 7 lg ,

П р и м е р 4. Получение антигена аденовируса КРС I подгруппы (1-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек Таурус-2, выращенных в стационарных матрасных колбах.

Культуру на уровне 100 пассажа готовят по примеру 1, но используют на четвертые сутки после экспланта- ции, когда формируется монослой. При заражении вводят аденовирус 1-го серотипа, штамм Bovine-10 с множественностью 0,1 ТЦД50/клетку, адсорбцию проводят в течение 90 мин при 37°С. Все последующие процедуры осуществляют по примеру 1. Сбор вируса проводят через 96 ч. Титр аденовируса равен 4,5 lg , что не ниже титра вируса, полученного в параллельных опытах на первичной культуре клеток почек эмбриона коровы.

30

35

40

П р и м е р 5. Получение антигена аденовируса КРС I подгруппы (1-й се- 45 ротип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-2, выращенных в роллерах. Культуру на уровне 100 пассажа готовят по примеру 2, но монослой формируется и четвертые сутки. При заражении вводят аденовирус 1-го серотипа, штамм Bovine-10 с множественностью 0,2 ТЦЦ50/клетку. Все последующие процедуры осуществляют по примеру 1. Сбор вируса проводят через 96 ч.

50

55

Титр аденовируса равен 5,5 1ЈТЦЦи/мл. В параллельных опытах на первичной культуре клеток почек эмбриона коровы титр вируса составил 5 1§ТЦЦи/мп,,

вируса проводят в течение 1 ч 37°С. После этого вносят до

б./мин. На следующие сутки дояют 250 мл свежей питательной ы того же состава. Через 72 ч е формирования монослоя на МН, у роста удаляют, а на клетки в 10 мл вирусосодержащей суспенс титром 4,75 lg . Адс

П р и м е р 5. Получение антигена аденовируса КРС I подгруппы (1-й се- ротип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-2, выращенных в роллерах. Культуру на уровне 100 пассажа готовят по примеру 2, но монослой формируется и четвертые сутки. При заражении вводят аденовирус 1-го серотипа, штамм Bovine-10 с множественностью 0,2 ТЦЦ50/клетку. Все последующие процедуры осуществляют по примеру 1. Сбор вируса проводят через 96 ч.

Титр аденовируса равен 5,5 1ЈТЦЦи/мл. В параллельных опытах на первичной культуре клеток почек эмбриона коровы титр вируса составил 5 1§ТЦЦи/мп,,

516329

П р и м е р 6. Получение антигена аденовафуса КРС II подгпуппы (7-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-4, выращенных в стационарных матрасных колбах. Культуру на уровне 145 пассажа готовят по примеру 1, ее ис- пользуют на четвертые сутки после формирования монослоя. При заражении jg вводят аденовирус 7-го серотипа, тамм Русь 18/81 - 0,1 ТЦЦ50/клетку. Все последующие процедуры осуществлят по примеру 1. Сбор вируса провоят через 112 ч. Титр аденовируса ра- 15 вен 5,5 lg ТЦЦдо/мл- в параллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка титр равен 4S5 lg

ТЦД5о/мл.

Пример 7. Получение антигена 20 аденовируса КРС II подгруппы (7-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Тяурус-4, выращенных в роллерах. Культуру на уровне 145 пассажа готовят по приме- 25 ру 1, ее используют на третьи сутки, когда сформировался монослой. При заражении вводят аденовирус 7-го сероти- па, штамм Русь 18/81 - 0,2 ТЦЦщ/клетку. Все последующие процедуры осу- 30 ществляют по примеру 1. Сбор вируса проводят через 96 ч. Титр аденовируса

73&

равен 6,25 lg . В параллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка составил 5,5 lg ТЦЦёо/мл.

Т г. ким образом, предлагаемый способ размножения аденовирусов КРС разных на предлагаемых линиях перевиваемых клеток почек теленка, имеющихся в большом количестве в жидком азоте, является перспективным и высокоэкономичным.

Формула изобретения

Способ получения антигена аденовирусов крупного рогатого скота, включающий выращивание культуры клеток и заражение вирусом с последующей инкубацией, отличающий- с я тем, что, с целью увеличения вькода целевого продукта, в качестве культуры клеток используют перепиваемые линии клеток почек теленка, выбранные из группы: Таурус-1, Таурус-2 ВСКК (ДП) № 007 и Таурус-4 ВСКК (ДП) № 010, при этом выращивание культуры клеток осуществляют в течение 3- 4 дн., а заражение вирусом осуществляют с множественностью 0,1-0,2 ТЦД на клетку.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается получения антигенов аденовирусов крупного рогатого скота, необходимых для создания вакцин, диаг- ностикумов и других биологических препаратов, а также для проведения научно-исследовательских работ. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается использованием перевиваемых линий клеток почек теленка, выбранных из группы: Таурус-1, Тау- рус-2 ВСКК (ДП) № 007 и Таурус-4 ВСКК (ДП) № 010, при этом выращивание культуры клеток осуществляют в течение 3-4 дн„, а заражение вирусом осуществляют с множественностью О, 1- 0,2 Т1Щ5о на клетку. &