Способ флуоресцентного иммуноанализа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам проведения лантанидного флуоресцентного иммуноана- лиза, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, микробиологической промышленности, а также в научных исследованиях для определения биологически активных соединений.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для приготовления иммуносорбента на полистирольную поверхность сорбируют антиген или антитело, насыщают сорбент инертным белком (БСА) Инкубируют имму- носорбент с анализируемыми пробами. Вносят специфический коньюгат (антитело- хелатирующий лиганд), инкубируют. После промывания добавляют Еи + в концентрации 10 6 - М в цитратном ( - М)

или ацетатном (50-100 мМ) буфере, рН 4,5- 5,5. Инкубируют в течение 20-60 мин при комнатной температуре, избыток удаляют, твердую фазу обрабатывают промывным раствором, содержащим - М ДТРА или ЭДТА в течение 2-10 мин при комнатной температуре. После промывания добавляют усиливающий раствор, перемешивают на встряхивателе в течение 10-15 мин, измеряют флуоресценцию Ей на флуорометре с временной дискриминацией сигнала.

Пример. Определение моноклональ- ных антиинсулиновых антител.

На полистирольные микропланшеты (Eflab, Helsinki), иммобилизовали инсулин (10 мкг/мл) в 100 мкл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,2 (буфер № 1), инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Выполняли трехкратное промывание раствором, содержащим 9 г/л NaCI и 0,5 г/л МаМз. Насыщали полистирольную поверхО 4 ГО О

о

ность БСА (5 г/л) в 250 мкл буфера № 1 в течение 2 « при 37°С. После трехкратного промывания наносили по 100 мкл антиинсу- линовых моноклональных антител (МКАТ) Ею, предварительно разведенных в буфере № 2, содержащем 50 мМ трис-НС1, 9 г/л NaCI, 0,5 г/л №N3, 5 г/л БСА, 0,5 г/л бычьего глобулина, 1 мл/л твина 20, в диапазоне концентраций - М, инкубировали 1 ч при 37°С. Лунки трижды промывали и вносили специфический конъюгат, кроличьи антимышиные антитела (КАМ) - диэтилент- риаминтетраацетат(ДТТА}- ЕИЗ+, 6 мкг/мл, в буфере 2, дополнительно содержащем М ДТРА и 5 х М СаС(2, по 100 мкл, инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После трехкратного промывания добавляли усиливающий раствор (LKB - Wallac), 100 мкл, перемешивали на встряхивателе в течение 10 мин, измеряли флуоресценцию на флуо- рометре Arcus 1230. В контрольных лунках анализ воспроизводили без этапа нанесения МКАТ Ею. Минимальная концентрация МКАТ ЕЮ, при которой сигнал опыта в 2 раза превосходил сигнал контроля, составила 1,26х .

После приготовления иммуносорбента, нанесения МКАТ Ею аналогично описанному наносили специфический конъюгат, КАМ - ДТТА, б мкг/мл, по 100 мкл в буфере № 2,

дополнительно содержащем 10 М ДТРА и 5 х М CaCIa, инкубировали 1 ч при 37°С. После трехкратного промывания добавляли EuClz (6,6 х М) в 100 мкл 75 мМ ацетатного буфера, рН 5,0, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Обрабатывали твердую фазу промывным раствором, содержащим М ДТРА и М CaCIa, в течение 5 мин при комнатной температуре, затем промывали 3 раза. Добавляли усиливающий раствор (100 мкл), перемешивали на встряхивателе в течение 10 мин, измеряли флуоресценцию на флуорометре Arcus 1230. В контрольных лунках анализ

воспроизводили без этапа нанесения МКАТ Ею. Минимальная концентрация МКАТ Ею. при которой сигнал опыта в 2 раза превосходил сигнал контроля, составила 6 х М. Предлагаемый способ флуоресцентного

иммуноанализа позволяет определять МКАТ Ею в концентрации б 10 М, в то время как известный способ имеет чувствительность 1,26

ю-10м.

20

Формула изобретения

Способ флуоресцентного иммуноанализа, включающий взаимодействие иммуносорбента, исследуемого образца и меченного Ей конъюгата с хелатирующим агентом с последующей оценкой иммунной реакции по , отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, введение ионов Ей в конъюгат

осуществляют после взаимодействия реагентов в концентрации 2 ,4 в ацетатном 50-100 мМ буфере с рН 4,75- 5,5 и инкубируют в течение 20-60 мин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам проведения иммуноанализа, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, промышленности для определения биологически активных соединений Целью изобретения является повышение чувствительности лан- танидного флуоресцентного иммуноанали- за. Введение ионов европия в конъюгат, представляющий собой антитела, связанные с хелатирующим агентом, производят после осуществления иммунной реакции в концентрации 2 ,4 М в ацетатном 50-100 мМ буфере с рН 4,5-5,5 и инкубируют в течение 20-60 мин. Таким образом, достигается чувствительность в определении МКАТЕю 6 М, прототип имеет чувствительность 1,26 М.