Способ дифференциальной индикации вирусспецифических нуклеотидных последовательностей вируса герпеса простого типа 1 и 2. Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/68 C12N15/38 

Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной экспресс-диагностик герпетической инфекции, основанной на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с двумя зондшш, каждый из которых типо- специфичен„

Цель изобретения - повышение точности дифференциации,,

Способ дифференциальной экспресс- диагностики герпетической инфекции основан на молекулярной гибридизации ДИК исследуемых вирусов с ДНКзондами, представленными гибридными плазмидаии рНС1021 и рНС2014, содер- жацими типоспецифические фрагменты геномов ВПГ 1 и 2. При этом два предложенных ДНК-зонда рНС 1021 и рНС 2014 обеспечивают дифференциальную типоспецифичную индикацию вирусспеци- фических нуклеотидных последовательностей вирусов простого герпеса двух серотилов - индивидуально ВПГ 1 и ВПГ 20

Способ молекулярной ДНК-ДНК гибридизации заключается в том, что

тВнаЦеЛле осуществляют выбор гибридной плазмиды, содержащей тнпоспецифичес- кий фрагмент геномов ВПГ 1 или 2 в варианте молекулярной слот -гибри- диэации,,

Использованный при разработке изобретения способ дифференциальной индикации внрусспецифических нукле- отидных последовательностей герпеса простого типа 1 и 2 библиотек EcoR 1 фрагментов ДНК ВПГ 1 и 2 получен при помощи космидного вектора рНС790 Кос- мидный вектор рКС79 сконструирован на основе плаэмиды pBR 322 со встро- енными по Pvu II сайту 1,97 тыс0 пар нуклеотидов Bgl II фрагментом ДНК ftch 44, несущим cos-участок

В качестве типоспецифичных ДНК- зондов используютт плазмиды рСН 1021 и рСН 2014 размером 36, 36 и 3,33 тысt пар нуклеотидов соответственнОоПлаз- мида рСН 1021 имеет вставки F, H-EcoR 1 фрагментов ДНК ВПГ 1 размером 15,61 и 14,85 тыСоПар нуклеотиков,которые соответствуют 0,300-0,380 и 0,875- 0,950 единицам физической карты.

Гибридная плазмида рСН 1021 содержит 3 сайта EcoR 1, 3 сайта Hind III, 3 сайта Bgl Не В составе рСН 1021 присутствуют последовательности М,1, Н,1 Bgl II, F, H, EcoR 1 и А, N, С Hind III фрагментов ДНК ВПГ 1 „ Эти участки генома кодируют основные поверхностные гликопротеиды ВПГ 1 gpA, gpB (участки 0,3-0,4), gpD иgpG (участки 0,87-0,95) и являются наименее консервативными в отношении перекрестной гибридизации„ Выбор этой конструкции в качестве типоспецифич- ного зонда обусловлен тем, что участки генома ВПГ 1 в области 0,3-0,4 и 0,85-0,95 единиц карты имеют наименьшую гомологию с ДНК ВПГ 2„

Плазмида рСН 2014 имеет вставки N, 0-EcoR I фрагментов ДНК ВПГ 2 размерам 5,90 и 2,42 тысо пар нуклеотидов, которые соответствуют 0,892- 0,937 и 0,937-0,950 единицам физической карты генома вируса , Гибридная плазмида содержит 3 сайта EcoR 1, 2 сайта Hind III, 3 сайта Bgl II„ В составе рСН 2014 присутствуют последовательности 1, К Bgl II, N 0 EcoR I, I, К Hind III фрагментов ДНК ВПГ 2„ Эти участки генбма кодируют поверхностные гликопротеиды ВПГ 2 р и р (участок 0,892-0,950) и являются наименее консервативными в отношении перекрестной гибридизациио Выбор этой конструкции в качестве т ипоспецифичного зонда обусловлен тем, что участок генома ВПГ 2 в области 0,892-0,950 единиц карты имеет наименьшую гомологию с ДН ВНГ 1.

Пример 1„ На каждый из нитро целлюпозных фильтров в количестве 9 штук наносят серию пятен ДНК, ВПГ 1 (итамм Ф,) в количестве от ДНК в пятне, предварительно денатурированную нагреванием в течение 15 мин на кипящей водяной бане„

ДНК фиксируют на фильтре в течение 2 ч при 80°С„ После прегибриди- зации фильтра в соответствующем буфере при 65°С в течение 4-8 ч проводят гибридизацию с зондом в течение ночи при 65°Со предварительно денатурируют кипячением на водяной бане в течение 10 мин0

В качестве буфера для прегибриди- зации и гибридизации используют раствор следующего состава: 5-кратный раствор Денардта (фиколл - 10, поли- винилпирролидон - 10, бычий сывороточный альбумин - 10, г/л); 0„75 М Nad, 0,075 М цитрат На; 0,2% доде- цилсульфат На; денатурированная ДНК спермы лосося в концентрации 10мкг/мл раствора„

В качестве зондов используют ДНК рекомбинантных плазмид рСН 1021 и рСН 20140 ДНК рекомбинантных плазмид предварительно метят радиоактивным фосфором гР в составе нуклеотидного предпественпика с применением метода ДНК-трансляциио Радиоактивность Р- ДНК-зонда составляет 210 имп/мин мкг„ Состав буфера для НИК-трансля- ции: 1 мкг ДНК-зонда, по 1 мкл 1 мМ раствора каждого из немеченых , 2Р- дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и меченых Э2Р-дИТФ с общей радиоактивностью 2-10е имп/мин, 5 мкл- буфера для НИК-трансляции (буфер 10-кратный для ИНК-трансляции состава 0,5 М Трис-HCl, рН 7,2; 0,1 II MgS04, 1 мМ дитиотрейтол и 500 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина), 5-10 ед„ак- тивности ДНК-полимеразы 1 и до общего объема реакционной смеси 50 мкл Реакцию НИК трансляции проводят по известной методике

Р-ДНК-зонда отделяют от дезокси- рибонуклеотидтрифосфатов на микроколонках с сефадексом G-50 хроматогра

516

фией с использованием центрифугирования.,

Р-ДНК-плазмиды, используемые в качестве зонда, денатурируют кипячением на водяной бане при 100°С в течение 10 мин с последующим охлаждением во льду, а затем проводят гибридизацию в течение 3-4 ч при 65 °С, помещая фильтр лицевой стороной на гибридизационную смесь (буфер для гибридизации с денатурированным Р-ДНК-зондом) и наслаивая вазелиновое масло для герметизации,,

Отмывку фильтров после гибридизации осуществляют следующим образом

Хлороформ - в течение 3-5 мин„

0,ЗМ Had, 0,ОЗМ цитрат Na; 0,5% додецилсульфат Na - в течение 5 мин при комнатной температуре„

0,ЗМ NaCl, 0,03H цитрат Na; 0,1% додецилсульфат Na - в течение 15 мин при комнатной температуре„

0.15М NaCl, 0.025M цитрат Na; 0,5 додецилсульфат Na - в течение 2 ч пр 65 С с однократной сменной буфера„

После отмывки фильтр высугшвают н воздухе и подвергают авторадиографи- рованию в течение 12 ч с применением медицинской рентгеновской пленки OPW HSII и двух усиливающих экранов ЭУИи

Положительными считаются пробы, даюьтие четкие пятна засветки на радиоавтографе.

Оптимальным вариантом является использование ДНК-зондов рНС 1021 (ЕсоК I - F, II фрагменты), и рНС 2014 (EcoR I - N, 0 фрагменты), в функциональном отношении соответствующих типоспецнуичнон вирусной детерминанте гликопротеидов ВПГ 1 и 2 соответственно Чувствительность предлагаемого способа высока и способствует вирусной ДНК при 5-10у вирусных геномов о

Формула изобретения Способ дифференциальной индикации вирусспецифических нуклеотидных последовательностей вируса герпеса простого типа 1 и 2, основанный на молекулярной гибридизации кислот с ДНК- зондом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности дифференциации, в качестве ДНК-зонда используют рекомбинантные плазмиды рНС1021/и рНС 2014, содержащие участки генома вируса герпеса 1 и 2 типа, соответствующие вирусным детерми-

пантам шшкопротеидов вируса герпеса простого 1 и 2 типа.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной экспресс-диагностики герпетической инфекции, основанному па молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Целью изобретения является повышение точности дифференциациис Способ заключается в дифференциальном выявлении ви- русспецифических нуклеотидных последовательностей простого герпеса типа 1 и 2 с помощью молекулярной ДНК-ДНК- гибридизации двух ДНК-зондов, каждый из которых представлен гибридной плаз- мидой, содержащей типоспецифический фрагмент, генома вируса простого герпеса типа 1 и 2с Чувствительность предлагаемого метода соответствует л. 1 О5 мкг вирусной ДНК о Способ позволяет проводить анализ болылого количества образцов одновременно. Л