КРАТНОМЕЧЕННАЯ ТРИТИЕМ ПО ДВОЙНЫМ СВЯЗЯМ 15-ГИДРОКСИ-5Z,-8Z,11Z, 13Е-ЭЙКОЗАТЕТРАЕНОВАЯ КИСЛОТА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК C07C57/03 C12P7/64 

Изобретение относится к химии природных и физиологически активных соединений и может найти применение в медицине и ветеринарии.

Ациклические метаболиты полиненасыщенных кислот - гидроксиэйкозатетраеновые и гидропероксиэйкозатетраеновые кислоты, лейкотриены, липоксины и др. образующиеся в организме при ферментативной трансформации полиеновых кислот, входящих в состав липидов клеточных мембран, играют ключевую роль в развитии воспалительных и аллергических состояний.

Будучи предшественниками лейкотриенов и липоксинов, гидроксиэйкозатетраеновые и гидропероксиэйкозатетраеновые кислоты могут быть использованы для диагностики предвоспалительных и предаллергических патологий. При этом необходима разработка методов определения этих эйкозаноидов в биологических объектах. Среди этих методов широко используется радиоимунный и иммуноферментный методы анализа. Для реализации этих аналитических подходов необходима разработка препаративных методов синтеза меченных тритием гидроксиэйкозатетраеновых кислот.

Наиболее приемлем ферментативный синтез, в котором необходимы два основных компонента: субстрат и фермент.

Известен способ ферментативного синтеза 15-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-эйкозатетраеновой кислоты с использованием в качестве субстрата аммониевой соли арахидоновой кислоты, а в качестве фермента 15-липоксигеназы, выделенной из соевых бобов (препарат фирмы Fluka Швейцария), причем процесс проводят в условиях насыщения реакционной среды кислородом (Hamberg M. Samuelsson B. J. Biol. Chem. 1967, v. 242, p. 5329) (1).

Однако кратномеченную тритием по двойным связям 15-гидрокси-5Z,8Z,11Z, 13E-эйкозатетраеновую кислоту данным известным способом не получали. При этом известный способ описан неинформативно, что не позволяет рассчитать выход целевого продукта. К тому же процесс его получения данным известным способом длителен: инкубация фермента с субстратом проводится в течение 30 минут.

Известен способ ферментативного синтеза 15-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-эйкозатетраеновой кислоты. В способе использован субстрат в виде арахидоновой кислоты, а в качестве фермента - 15-липоксигеназа, выделенная из бобов сои (препарат фирмы Serva, ФРГ).

Инкубация фермента с субстратом по данному известному способу длится 10 мин. Выход целевого продукта составляет 40% (Белослудцев Ю.Ю. и др. Биоорганическая химия, 1989, т. 15, N 9, с. 1224 1231) (2).

Однако выход целевого продукта при реализации данного известного способа низок (40%). При этом меченную тритием 15-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-эйкозатетраеновую кислоту данным известным способом не получали.

Известна кратномеченная тритием по двойным связям 5Z,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеновая кислота (арахидоновая кислота) (Мягкова Г.И. и др. Биоорганическая химия, 1982, т. 8, N 2, с. 255 260) (3).

Однако ферментативный синтез кратномеченной тритием по двойным связям 15-гидрокси-5Z, 8Z, 11Z,13E-эйкозатетраеновой кислоты, исходя из данного известного субстрата, не описан.

Техническим результатом, достигаемым с помощью настоящего изобретения, является получение нового кратномеченного тритием по двойным связям ациклического метаболита полиненасыщенных кислот - 15-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-[³H] -эйкозатетраеновой кислоты, повышение выхода данного целевого продукта по сравнению с известным способом (2) ферментативного синтеза 15-гидрокси-5Z, 8Z, 11Z,13E-эйкозатетраеновой кислоты, исходя из арахидоновой кислоты, упрощение способа за счет проведения синтеза в условиях, не требующих насыщения реакционной среды кислородом.

Пример 1.

Получение фермента.

100 г соевой муки экстрагируют гексаном, осадок фильтруют, экстрагируют 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0) при +4^oC. Суспензию фильтруют, центрифугируют 10 мин при 13000 g. Супернатант доводят до 30% насыщения (NH₄)₂SO₄, центрифугируют 10 мин при 13000 g. Супернатант доводят до 60% насыщения (NH₄)₂SO₄, центрифугируют, растворяют осадок в 10 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0) и диализуют против буфера. Очистку белка проводят ионнообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе. Раствор белка после очистки подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 2.

Препаративный ферментативный синтез равномерно меченной тритием по двойным связям 15-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-эйкозатетраеновой кислоты.

50 мл 0,1 М натрий-боратного буфера рН 9,0 насыщали кислородом, добавляли 50 мкл 0,5 М раствора [³H]-арахидоновой кислоты в гексане (до концентрации 500 мкМ), 1 мл раствора 15-липоксигеназы концентрацией 12,5 мг/мл. Инкубировали 10 мин при комнатной температуре (20 22^oC) в токе кислорода, затем образовавшуюся промежуточную 15-гидроперокси-[³H]-эйкозатетраеновую кислоту восстанавливали добавлением двухкратного молярного избытка NaBH₄. Реакцию останавливали добавлением 1,5 мл 1 М раствора лимонной кислоты до рН 3,5, экстрагировали этилацетатом дважды по 100 мл, промывали экстракт дистиллированной водой, сушили безводным сульфатом натрия, упаривали, растворяли в 1 мл смеси изопропиловый спирт-гексан (2:50); целевой продукт выделяли методом ВЭЖХ на силикагеле в элюенте изопропиловый спирт-гексан (2:50). Время удерживания 15 мин. Из 7,5 мг [³H]-арахидоновой кислоты получили 5,6 мг 15-гидрокси-5Z, 8Z,11Z,13E-³H-эйкозатетраеновой кислоты (75%) с чистотой 99% (ВЭЖХ).

УФ-спектр: сопряженный диеновый хромофор с λ_maX 234,5 нм
ПМР-спектр δ, м.д. (спектр немеченного соединения, полученного в аналогичных условиях: 0,88 (т, J 7 Гц, 3Н, С-20), 1,00 2,08 (м, 10Н, С-3+С-16+С-17+С-18+С-19), 2,13 (дт, J 7 Гц и 7 Гц, 2Н С-4), 2,35 (т, J 7 Гц, 2Н, С-2), 2,82 (дд, J 6 Гц, 2Н, С-7), 2,98 (м, 2Н, С-10), 4,27 (дт, J 6 Гц и 6 Гц, 1Н, С-15), 5,39 (м, 5Н, С-5+С-6+С-8+С-9+С-11), 5,75 (дд, J 15,0 Гц и 6 Гц, 1Н, С-14), 5,98 (дд, J 11 Гц, 11 Гц, 1Н, С-12), 6,61 (ддт, J 16,0; 11; 1,5 Гц, 1Н, С-13).

Пример 3
По методике примера 2 определили соотношение субстрат-фермент. Результаты приведены в таблице 1.

Пример 4.

Изучение влияния условий проведения ферментативной реакции на выход 15-гидрокси-[³H]-эйкозатетраеновой кислоты.

При работе с миллиграммовыми количествами [³H]-арахидоновой кислоты ее молярная радиоактивность не может быть максимальной. Так, при молярной радиоактивности, равной 6,9 ПБк/моль, пришлось бы оперировать с радиоактивностью, равной 150 200 ТБк (4,0 5,4 К), что не вызвано коммерческой необходимостью, требует больших количеств дорогостоящей ³H-арахидоновой кислоты и вызывает опасность радиоактивного загрязнения. Поэтому целесообразно работать с [³H] -арахидоновой кислотой с радиоактивностью не выше 70 ТБк/моль (0,07 ПБк/моль).

При использовании высокомеченной [³H]-арахидоновой кислоты необходимо работать с микрограммовыми ее количествами. В связи с этим были специально подобраны условия анализа и очистки реакционных смесей.

Так, ВЭЖХ проводили на хроматографе "Милихром" (Россия) на колонке 2х60, Силасорб 5С₁₈ в ступенчатом градиенте смесей растворителей метанола, воды и уксусной кислоты в соотношениях:
а) 85:15:1 (0,8 мл);
б) 75:25:1 (0,4 мл);
в) 70:30:1 (0,8 мл),
скорость 100 мкл/мкл при многоволновой детекции; на хроматографе "Гилсон" (Франция) в смеси растворителей: метанол-вода-уксусная кислота (70: 30: 0,1) на колонке 3,3х150 мм, Сепарон SGX 5C₁₈, скорость 0,5 мл/мин, время удерживания для 15-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты 33,74 мин.

В таблицах 2, 3, 4 представлена зависимость выхода 15-гидрокси-[³H]-эйкозатетраеновой кислоты от условий проведения ферментативной реакции.

Зависимости, представленные в таблицах 2, 3, 4, позволили сделать вывод о том, что при использовании микрограммовых количеств меченой арахидоновой кислоты оптимальными являются следующие условия: использование 12 16 мкг меченой кислоты (субстрата) в 0,7 1,0 мл буфера при соотношении субстрат-фермент 1: 2 (мкг/мкг). При этом оказалось, что при использовании микрограммовых количеств меченой арахидоновой кислоты не было необходимости насыщать среду кислородом и вести реакцию в токе кислорода, содержание кислорода в буфере в избытке хватает для осуществления биосинтеза. Кроме того, проведение реакции в сильно разбавленных растворах существенно снижает радиолиз меченых эйкозаноидов, что обеспечивает повышение выхода целевого продукта.

Пример 5.

Ферментативный синтез кратномеченной 15-гидрокси-[³H]-эйкозатетраеновой кислоты.

12 16 мкг [³H] арахидоновой кислоты в 3 мл метанола вносят в 5 мл реакционную колбу, упаривают и суспензируют на шейкере в 1,0 мл боратного буфера. Затем добавляют 30 40 мкл раствора 1,5-липоксигеназы (0,8 мг/мл) в том же буфере. Реакцию и очистку проводят, как описано в примере 2 без использования кислорода, но при интенсивном перемешивании. Выход меченого препарата 60 65% с молярной радиоактивностью 6,0 6,2 ПБк/моль.

Таким образом, при использовании фермента соевых бобов с удельной активностью 10,9 мкмоль/мин•мг и субстрата с молярной радиоактивностью, равной 6,9 ПБк/моль, и радиоактивностью не выше 0,07 ПБк/моль новый способ позволяет получить целевой продукт с выходом 60 65% и за короткое время инкубирования с возможностью использования микрограммовых количеств субстрата.

Использование: в медицине, ветеринарии. Сущность изобретения: получено новое кратномеченное тритием соединение: 15-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-[³H]-эйкозатетраеновая кислота. Субстрат в виде кратномеченной тритием по двойным связям [³H] арахидоновой кислоты инкубируют с ферментом в виде 15-липоксигеназы, выделенной из бобов сои и имеющей удельную активность 10,9 мкмоль/мин•мг. После 10 - 15 мин инкубации промежуточный продукт восстанавливают добавлением двухкратного молярного избытка NaBH₄. Затем реакционную смесь подкисляют до рН 3,5 и выделяют целевой продукт. При этом субстрат в количестве 12 - 16 мкг растворяют в 0,7 - 1,0 мл 0,1 М натрий-боратного буфера рН 9,0, добавляют фермент в количестве, обеспечивающем соотношение субстрат - фермент, равное 1:(15 - 20) (мкг/мкг). Инкубацию проводят при температуре 20 - 22^oC. 2 с. п. ф-лы, 4 табл.

1. Кратномеченная тритием по двойным связям 15-гидрокси-5Z, 8Z, 11Z, 13Е-эйкозатетраеновая кислота. 2. Способ получения кратномеченной тритием по двойным связям 15-гидрокси-5Z, 8Z, 11Z, 13Е-эйкозатетраеновой кислоты, включающий инкубацию субстрата с 15-липоксигеназой из соевых бобов в течение 10 15 мин, восстановление промежуточного продукта, подкисление среды до pН 3,5, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что фермент используют с удельной активностью 10,9 мкмоль/(мин•мг), а в качестве субстрата - [³Н]-арахидоновую кислоту, при этом субстрат перед инкубацией растворяют в 0,7 1,0 мл 0,1 М натрий-боратного буфера, рН 9,0 и инкубирование проводят при 20 22^oC при соотношении субстрат фермент 1:1,5 2,0(мкг/мкг).