Способ определения степени биозараженности виноматериалов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/14 

сл

С

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к винодельческой, и касается идентификации происхождения пороков и повышения достоверности определения поражения молочнокислыми бактериями соков и виноматериалов по готовому продукту Цель изобретения - повышение точности определения биозараженности виноматериала молочнокислыми бактериями рода Lactobaclllus. Это достигается тем, что оценку проводят по концентрации орнитина при ее превышении 12 ± 2 мг/дм в исследуемом продукте. 1 табл.

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к винодельческой, и касается идентификации происхождения пороков и повышения достоверности определения поражения молочнокислыми бактериями рода Lactobacillus соков и вино- материалов по готовому продукту.

Целью изобретения является повышение точности определения биозараженности виноматериалов молочнокислыми бактериями рода Lactobacillus.

Из средней пробы сока, виноматериала и вина с мышиным тоном выделяют с последующим определением качественного и количественного состава свободные аминокислоты и по концентрации орнитина судят о пути возникновения мышиного тона в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий рода Lactobacillus. Среднюю пробу образца в количестве 5 см наносят на колонну с смолой КУ-2 в Н -форме. Ор- нитин элюируют градиентным раствором

аммиака 2М 100 см3 и 4н 200см3 Объединенный элюат упаривают досуха, перерастворяют в бидистиллированной воде и вновь упаривают досуха.

По концентрации орнитина судят о причине возникновения порока: до 12 ± ± 2 мг/дм - окислительно-восстановительный, выше 12 ± 2 мг/дм3- микробиаль- ный путь образования пороков.

Пример 1. Виноград белых сортов перерабатывают на дробилке-гребнеотде- лителе, полученную мезгу прессуют. Отбирают сусло-самотек и первое давление. Сусло осветляют отстаиванием, охлаждают и после снятия с осадка спиртуют для получения спиртованного сока крепостью 16 об.% спирта. Спиртованный сок хранят при 4-8°С в течение года. В соке при хранении образуется мышиный тон. Отбирают среднюю пробу, которую разделяют на две части. Одну часть пастеризуют и фильтруют

о сл

N vj

&

через обеспложивающий фильтр, получают стерильную пробу образца. По 10 см3 исходной и стерильной пробы спиртованного сусла центрифугируют 15 мин при 3 тыс. об./мин. Центрифугат удаляют, а осадок микроскопируют. В исходном образце после центрифугирования определяют в поле зрения скопление молочнокислых бактерий рода Lactobaclllus в виде тонких палочек, расположенных отдельно и в виде цепочек. В стерильной пробе не обнаруживают болезнетворные бактерии. Для провоцирования роста бактерий проводят посев образца на питательную среду с последующим тер- мостатированием при 30°С в течение 4-6 сут. После микроскопирования стерильной пробы молочнокислые бактерии не обнаружены.

По 5 см3 исходной и стерильной средней пробы спиртованного сока наносят на колонки со смолой КУ-2 в Н -форме совместно с внутренним стандартом - норлейци- ном в количестве 0,5 см при концентрации 0,25 М и промывают дистиллированной водой объемом 300 см3 для удаления редуци- рующих веществ. Орнитин в составе свободных аминокислот элюируют градиентным раствором аммиака в концентрации 2 н. 100 см3 и 4 н. 200 см3. Объединенный аммиачный элюат упаривают до сухого ос- татка, перерастворяют в 300 см3 бидистил- лированной воды и вновь упаривают до сухого остатка. Операцию перерастворения сухого остатка свободных аминокислот и упаривания в воде повторяют дважды, а за- тем его разводят в 5 см3 цитратно-литиевого буферного раствора с рН 2,2.

Трехкратное упаривание образца требуется для максимального удаления аммиака, который мешает определению орнитина. В порядке разделения в режиме свободных аминокислот на аминокислотном анализаторе орнитин элюируют сразу же за аммиаком. Анализ свободных аминокислот проводят на аминокислотном анализаторе. Разделение свободных аминокислот осуществляют на ионите Ostlon LGFA. Элюирова- ние орнитина проводят буферным раствором рН 5,0 при скорости буферного потока 14 смэ/ч и нингидринового реактива 12 см3/ч при температуре колонки 58°С. Определяют орнитин на 152-й минуте анализа. Количественное определение орнитина проводят по величине оптической плотности при 520 нм, которую переводят в соот- ветствующую концентрацию (мг/дм3) по калибровочному графику.

Качественный и количественный состав свободных аминокислот исходного и стерильного спиртованного сока приведен в таблице.

Пастеризация образца не влияет на качественный и количественный состав свободных аминокислот. Концентрация орчи- тина в обоих вариантах опытов в пределах 40 мг/дм , что выше нормального содержания его в здоровом соке (12 ± 2 мг/дм. В этом соке были обнаружены молочнокислые бактерии рода Lactobacltlus. В результате их жизнедеятельности произошло увеличение орнитина ц образовался мышиный тон. Стерильный образец не дал роста микроорганизмов.

П р и м е р 2. Виноград сорта Траминер перерабатывают на дробилке-гребнеотде- лителе, полученную мезгу прессуют и отбирают сусло-самотек и первое давление. Сусло осветляют отстаиванием при охлаждении с добавлением 2 г/дал бентонитовой суспензии. Осветление проводят в течение 18-20 ч и снимают с осадка. Осветленный сок крепят до концентрации 16 об.% этиловым спиртом и хранят в течение года. В соке образовался мышиный ток. Из образца отбирают среднюю пробу, которую делят на две части. Одну часть пробы пастеризуют и фильтруют через обеспложивающий фильтр, получают стерильную пробу образца. Исходную и стерильную пробы образца готовят для микроскопирования и микроскопируют. Болезнетворные микроорганизмы в обеих пробах образца не обнаружены. Для провоцирования роста бактерий проводят посев проб на питательный раствор. Пробы выдерживают в термостате при 30°С в течение 4-6 сут. По истечении этого времени в пробах образца при микроскопиро- вании молочнокислые бактерии рода Lactobacillus не обнаружены. Они не размножились, т.е. образец здоровый.

Определение орнитина в исходном и пастеризованном спиртованном соке Траминер проводят следующим образом. По 5 см каждой пробы образца совместно с внутренним стандартом - 0,25 М раствором нор- лейцина в количестве 0,5 см наносят на колонки со смолой КУ-2 в Н+-форме и промывают 300 см3 бидистиллированной воды для удаления редуцирующих веществ. Элю- ирование орнитина в составе свободных аминокислот осуществляют градиентным раствором: 100 см 2 н. и 200 см 4 н. амми- ка. Аммиачный элюат упаривают до сухого остатка, который перерастворяют в бидистиллированной воде и вновь упаривают. Операцию перерастворения сухого остатка в бидистиллированной воде и упаривания повторяют дважды. Сухой остаток разводят в 5 см3 цитратно-литиевого буферного раствора при рН 2,2. Для максимального удаления аммиака проводят трехкратное упаривание элюата. Аммиак мешает определению орнитина. Уменьшение содержания аммиака увеличивает степень его разделе- ния с орнитином. Количественное определение орнитина проводят на аминокислотном анализаторе. Разделение свободных аминокислот осуществляют на ионите Ostion LGFA. Элюирование орнитина прохо- дит цитратно-литиевым буфером рН 5,0 при скорости буферного потока 14 см3/ч и нин- гидринового реактива 12 см /ч при температуре колонки 58°С. Элюируется орнитин на 152-й минуте анализа. Концентрацию ор- нитина определяют по величине оптической плотности при 520 нм, которую переводят соответствующую концентрацию (мг/дм3) по калибровочному графику.

По данным качественного и количест- венного состава свободных аминокислот исходной и стерильной пробы образца спиртованного сока сорта Траминер приведена концентрация орнитина в исходном и стерильном спиртованном соке практиче- ски одинаковая и не превышает 10 мг/дм3. Это позволяет сделать вывод: мышиный тон образовался в этом случае, только в результате окислительно-восстановительных реакций. Концентрация орнитина в этом образце не превышает его критического содержания для виноградной ягоды.

Предлагаемый способ позволяет установить наличие молочнокислых бактерий, образующих мышиный тон в результате своей жизнедеятельности, и обладает специфичностью определения, объективностью а оценке больших партий виноматериалов и виноградного сока, возможностью контролирования сока и виноматериалов на наличие продуктов жизнедеятельности болезнетворных молочнокислых бактерий. Благодаря высокой достоверности способа его можно использовать в качестве арбитражного метода в случае необходимости четкой идентификации причин возникновения мышиного тона.

Формула изобретения Способ определения степени биозара- женнссти виноматериалов по наличию аминокислоты, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения биозараженности виноматериала молочнокислыми бактериями рода Lactobaclllus, определение наличия аминокислоты осуществляют по концентрации орнитина в исследуемом продукте, превышающей 10 - 14 мг/дм3.

Продолжение таблицы