Способ проведения иммуноферментного анализа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/535 

ё

Изобретение относится к медицине, а именно к определению концентрации био- ЛОГИЧРСКИХ вещестр иммуноферментным анализом Цель изобретения - повышение чувствительности анализа Сенсибилизируют подложку инкубируют с исследуемыми Пробами затем отмывают подложку и вносят меченый коньюгат После добавления субстрата дополнительно вносят крахмал до концентрации 007-008% а непосредственно перед измерением ионов иода подложку прогревают при 60 70°С По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность анализа в 100 раз

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, сельскому хозяйству в частности к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ в различных средах и может быть использовано на предприятиях медицинской биотехнологической, пищевой промышленности.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Электрохимическое определение фермента-маркера осуществляют по молекулярному йоду - продукту пероксидазного окисления йодид-ионов перекисью водорода при рН 3,8-4,2 в присутствии 0,07-0,08% крахмала, с последующим разрушением комплекса крахмал-йод прогреванием при 60-70°С непосредственно перед измерением.

Пример В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 200 мкл у-глобулиновой фракции кроличьей антисыворотки против L-acnapa- гичазы содержащей 20 мкг/мл белка, на фоне 001 моль/л фосфатного буфера (рН 7 4) инкубируют 2 ч при 37°С, лунки промывают 4 раза 0,01 моль/л фосфатным буфером (рН 7,4) содержащим 0,15 моль/л хлористого натрия и 0,05% тритона Х-100 Затем вносят в лунки по 200 мкл растворов с различным содержанием коньюгата L-ac- парагиназа-пероксидаза на фоне промывочного буфера инкубируют в течение 1 ч при 37°С После чего повторяют операцию промывки 5 раз, вносят по 200 мкл субстратной смеси, содержащей 0,75 ммоль/л йодистого калия 0,3 ммоль/л перекиси водорода и 0,07% крахмала на фоне О 1 моль/л ацетатного буфера, рН 4 1 инкубируют 50 мин при комнатной температуре Регистрацию результатов проводят после инжекции 100

О

сл

Јь VI СЛ О

мкл пробы в проточную линию амперомет- рического датчика. Температуру проточной линии и датчика устанавливают равной 70 ±0,5°С.

П р и м е р 2. Определение проводят прямым методом связывания. Для этого в лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 200 мкл у-глобулиновой фракции кроличьей антисыворотки против L-аспарагиназы, содержащей 20 мкг/мл белка на фоне 0,01 моль/л фосфатного буфера (рН 7,4). инкубируют 2 ч прл 37°С. Лунки промывают 4 раза 0,01 моль/л фосфатным буфером (рН 7,4). содержащим 0,15 моль/л хлористого натрия и 0,05% тритона Х-100. Затем вносят в лунки по 200 мкл растворов с различным содержанием коньюгата L-аспарагиназэ-пероксида- за на фоне промывочного буфера, инкубируют 1 ч при 37°С. Операцию промывки повторяют 5 раз. Затем вносят по 200 мкл субстратной смеси, содержащей 0,75 ммоль/л йодистого калия, 0,3 ммоль/л перекиси водорода и 0,08% крахмала на фоне 0,1 моль/л ацетатного буфера (рН 4,1), инкубируют ВО мин при комнатной температуре. Регистрацию результатов проводят после инжекции 100 мкл пробы в проточную линию амперометрического датчика. Температуру проточной линии и датчика устанавливают равной 60 ± 0,5°С.

Статистически установлено (по t-крите- рию Стьюдента при Р 0,95), что нижний предел определения коньюгата предла0

5

0

5

0

гаемым методом равен 8 моль/л (1,0 нг/мл) по 1-аспарагиназе, по известному способу 1 -10 моль/л (13.0 нг/мл).

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает значительное повышение чувствительности иммуноферментного анализа с электрохимической детекцией как по ферменту-маркеру (с 1 10 до 6 моль/л), так и по меченому антигену (с 1 10 10до8 10 12 моль/л), т.е. в 100 раз по сравнению с известным способом.

Использование предлагаемого метода позволит проводит иммуноферментный анализ различных физиологически активных соединений, при наличии иммунопе- роксидазных диагностикумов с высокой чувствительностью. При этом становится возможным расширить круг определяемых объектов, содержание которых в анализируемых средах составляет пикомоли.

Формула изобретения

Способ проведения иммуноферментного анализа, включающий сенсибилизацию подложки, инкубацию с меченым коньюга- том, отмывку с последующим добавлением субстрата и измерением ионов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, после добавления субстрата дополнительно вносят крахмал в концентрации 0,07-0,08%, а перед измерением ионов подложку прогревают до 60-70°С.

35