Способ культивирования респираторно-синцитиального вируса Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 C12N5/00 

Изобретение относится к вирусологии и культивированию клеток.

Целью изобретения является повышение урожая респираторно-синцитиального вируса (РСВ).

Пример 1. Экспонирование сыворотки крупного рогатого скота (КРС) осуществляют в стерильных условиях (боксе) следующим образом: лампу марки БУФ-30 мощностью 30 Вт с длиной волны 254 нм размещают на расстоянии 20 см от поверхности сыворотки КРС, полученной обычным способом.

Сыворотку КРС наливают толщиной 0,8 см в стеклянную емкость плоским дном

и проводят ее обработку УФ-лучами в течение 30 мин при постоянном перемешивании.

Клеточную массу (HeLa) для последующего культивирования вирусов выращивают в роллерной системе в условиях 37°С на роллерном аппарате. Средой для культивирования являлась культуральная среда 199, в которую вносят экспонированную УФ-об- лучением сыворотку КРС до конечной концентрации 5%. Посевная концентрация ткани (200 - 800). 103 кл/мл в объеме 500 мл.

Скорость вращения аппарата составляет 12 об/мин. Длительность культивирования ткани составляет 5 сут. Пеоед

заражением клеточно-культуральную среду разводят средой Игла в соотношении 1:1, а рН среды доводят до 7,8 - 8,0.

После разведения клеточной культу- ральной среды вносят смесь ДМСО - трипсин 100 ЕД - 1:3 (в дальнейшем - триптоксид или Т) в количестве 5 мл на 500 мл клеточно-культуральной среды и продолжают инкубацию ткани в течение 1 ч.

После обработки Т (через 1 ч) инокули- руют ткань одновременно дефростирован- ной клеточно-культуральной среды, содержание СВ в титре 1:4096 - 1:25600 в соотношении 10 мл инокулянта на 100 мл клекточно-культуральной среды.

Через 18-24 ч получают урожай вируса путем удаления клеточно-культуральной среды из инкубационных бутылей. Клеточный монослой со стенок стекла удаляют с помощью 0,25%-ного трипсина, подогретого до 37°С на роллере за 15 мин при скорости вращения 60 об/мин.

Полученный пул клеток вносят в клеточ- но-культуральную среду, титр РСВ определяют только в клеточно-культуральной среде.

Определение титров РСВ в клеточно- культуральной среде проводят классическим методом РСК. Результаты приведены в табл.1.

П р и м е р 2. Способ проводят аналогично примеру 1, однако используют сыворотку КРС, размещая ее слоем толщиной 1 см в емкости на расстоянии 15 см от лампы УФ- 30. Время экспозиции 60 мин.

Экспонированную сыворотку КРС вносят в клеточно-культуральную среду в концентрации 10%. Обработку триптоксидом состава: 2,8 ч (70 мл) 0,25%-ного раствора трипсина 128 ЕД 1,2 ч (30 мл) ДМСО проводят за 2 ч до инокуляции вирусом при соотношении состав-ткань 0,8:100 -4 мл состава на 500 мл клеточно-культуральной среды. Результаты приведены в табл.2.

ПримерЗ. Способ проводят аналогично примеру 1, но используют УФ-экспони- рованную сыворотку КРС в течение 45 мин в концентрации 7% и триптоксид следующего состава: 3,2 ч. (80%) 0,25%-ного раствора трипсина, 0,8 ч (20%) ДМСО в количестве 4,5 мл на 500 мл клеточно-культуральной среды, вносимый за 1,5 ч до заражения тканей.

В таблицах 1- 3 представлены результаты по определению титра РСВ в клеточно- культуральной среде в 15 повторах.

Полученные результаты показывают неоспоримое преимущество Т, способного стимулировать инфекционную активность РСВ в 16 раз по сравнению с 0,25%-ным

раствором трипсина и в 64 раза по сравнению с ДМСО.

Таким образом, на основании полученных результатов по применению УФ-экспонированной сыворотки КРС и Т при культивировании PC-вируса имеет место не суммарный, а синергидный эффект, возникающий при смешивании 0,25%-ного трипсина 100 - 128 ЕД с цельным ДМСО.

0Применение Т позволяет получать урожай РСВ в 12,5 - 50 раз больше по сравнению с контролем и в 800 раз по сравнению с интактными клетками.

Анализ полученных результатов пока5 зывает, что использование триптоксида позволило получить 3,1 - 25 раз выше урожай по сравнению с контролем (0,25%-ный трипсин и ДМСО, взятые отдельно) и в 200 раз - по сравнению с интактными клетками.

0 Предлагаемый способ с использованием УФ-экспонированной сыворотки КРС и триптоксида позволяет получить урожай РСВ во много раз превышающий урожаи, полученные при использовании 0,25%-ного

5 трипсина 100 - 128 ЕД и ДМСО, взятых в отдельности: в сравнении с контролем урожай РСВ выше в 3,1 - 50 раз, в сравнении с интактными клетками - в 200 - 800 раз, при этом время культивирования сократилось с

0 5 - 8 сут до 2 - 4 сут.

Формула изобретения Способ культивирования респиратор- но-синцитиального вируса, включающий получение суспензии чувствительных кле5 ток в синтетической питающей среде с сывороткой, внесение -в нее в качестве стимулятора инфекционной активности ре- спираторно-синцитиального вируса диме- тилсульфоксида, последующую инкубацию

0 полученной смеси и внесение в нее вируса, отличающийся тем, что, с целью повышения урожая вируса, в качестве сыворотки используют сыворотку крупного рогатогоскота,обработанного

5 ультрафиолетовыми лучами в течение 30 - 60 мин, при этом сыворотку наливают слоем 0,8 - 1,0 см и размещают на расстоянии 15 - 20 см от источника излучения, а в качестве стимулятора инфекционной ак0 тивности респираторно-синцитиального вируса дополнительно используют раствор трипсина активностью 100 - 128 ЕД при следующем соотношении компонентов, об.ч.: диметилсульфоксид 1,2 - 3,2; раствор

5 трипсина активностью 100 - 128 ЕД 0,8 - 2,8, при этом указанную смесь вносят в суспензию чувствительных клеток в синтетической питательной среде с сывороткой в соотношении (0,8 - 1,0): 100 за 1 - 2 ч до внесения вируса.

Таблица 1

Изобретение относится к вирусологии и культивированию клеток. Цель изобретения - повышение урожая респираторно-синци- тиального вируса. Для этого при культивировании используется сыворотка крупного рогатого скота, предварительно обработанная ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 244 - 264 нм, мощностью излучателя 30 т в течение 30 - 60 мин, при этом сыворотку размещают на расстоянии 15 - 20 см от источника излучения и наливают слоем 0,8 - 1,0 см, после чего ее вносят в суспензию чувствительных клеток в синтетической питательной среде до конечной концентрации 5 - .10%. В клеточную суспензию также вносят стимулятор инфекционной активности вируса, в качестве которого используют смесь при следующем соотношении компонентов, об.ч.: диметилсульфоксид 1,2 - 3,2; 0,25%-ный раствор трипсина активностью 100 - 128 ЕД 0,8 - 2,8. При этом указанную смесь вносят в суспензию чувствительных клеток в синтетической питательной среде с сывороткой в соотношении 0,8 - 1,0: 100 за 1...2 часа до внесения вируса. fc

Таблица2

Таблица 3