Способ определения молочной кислоты Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения метаболитов с помощью ферментных электродов.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру Aerococcus vlrldans (коллекция ВНИИА, 1988, 167 VR) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 - 100-мкг DL-лактата лития, 30 - 50 мкг грамурина и 2 - 5 мкг этония на 1 мл среды при 32 - в течение 36 - 48 ч. Выросший

налет смывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7.4) с центрифугированием при 3000 об/мин.

На мембрану перевернутого сенсорной частью вверх электрода Кларка наносят 50 мкл смеси, состоящей из 2,7мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,6 - 6,8), 1,5 мл 17,5%-ного бычьего сывороточного альбумина и 100 мг влажного веса отлитой био- аассы клеток. Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны.

ON

СП

ел о

00 00

Добавляют 10 мкл 10%-ного глутарово- го альдегида с быстрым распределением его по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при +4°С в течение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной. Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 - 7,4).

Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и 10 мкл 0,1 М раствора DL- а-аланина.

Сенсорную часть электрода вводят в Микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения Оа, выражаемой в нМ Поглощенного Оа в 1 мин. Производят рас- ет концентрации молочной кислоты в об- разце согласно калибровочной кривой Зависимости скорости поглощения 62 при Ькислении DL-лактата лития в определенных концентрациях.

В табл. 1 приведены данные по скорости окисления D и L-стереоизомеров молочной Кислоты в присутствии 0,1 М DL-a-аланина и без него.

На чертеже приведен пример калибровочного графика. Интервал линейности составляет 0,5 -5,0 мкМ лактата.

В табл.2 показано стимулирующее действие предельных и оптимальных концентраций DL- а -аланина на окисление L-лактата.

П р и м е р 1. Культуру Aerococcus ylridans 167 VR (коллекция ВНИИА, Nfc 1688) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл DL-лактата лития, 30 мкг/мл грамурина и 2 мкг/м этония, при 32°С в течение 36 ч. Выросший налет смы- $ают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7,4) центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин.

На мембрану перевернутого сенсорной Частью вверх электрода наносят 50 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8) и 1,5мл 17,5%-ного бычьего сывороточного альбумина и 100 мг влажного веса отмытой биомассы клеток.

Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Добавляют 10 мкл 10%-ного глутарово- го альдегида с быстрым распределением его по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при +4°С в течение 8 ч, после чего

ферментный слой накрывают диализной мембраной. Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 - 7,4).

Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и 10 мкл 0,05 М раствора DL- «-аланина.

Сенсорную часть электрода Кларка вводят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощенияЮа, выраженной в нМ поглощенного 02 в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в

образце согласно калибровочной кривой зависимости поглощения 02 при окислении DL-лактата.

П р и м е р 2. Культуру Aerococcus

virfdans 167 VR (коллекция ВНИИА, № 1688) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл DL-лактата лития, 30 мкг/мл грамурина и 2 мкг/мл этония , при 32°С течение 36 ч. Выросший налет

смывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7,4) с центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин.

На мембрану перевернутого сенсорной

частью вверх электрода наносят 5 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8) и 1,5 мл 17,5%-ного бычьего сывороточного альбумина и 160 мл влажного веса отмытой биомассы клеток

Aerococcus vlridans 167 VR (коллекция ВНИИА, Ns 1688). Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Добавляют 1 мкл 10%-ного глутарового

альдегида с быстрым распределением его по поверхности .мембраны стеклянной палочкой.

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при +4°С в течение 8 ч, после чего

ферментный слой накрывают диализной мембраной. Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 - 7,4).

Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 1,0 мкл биологического образца и 10 мкл 0,1 М раствора DL- а-аланина. Сенсорную часть электрода Кларка вводят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения 02, выражаемой в нМ поглощенного 02 в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой

зависимости скорости поглощения 02 при окислении DL-лактата.

П р и м е р 3. Культуру Aerococcus vlridans 167 VR (коллекция ВНИИА, № 1688) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл DL-лактата лития, 30 мкг/мл грамурина и 2 мкг/мл этония при 32°С в течение 36 ч. Выросший налет смывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 - 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным буфером (рН - 7,4) с центрифугированием при 3000 рб/мин в течение 15 мин.

На мембрану перевернутого сенсорной частью вверх электрода наносят 5 мкя смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8) и 17%-ного бычьего сывороточного альбумина и 100 мл влажного веса отлитой биомассы клеток Aerococcus vlrtdans 167VR. Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклян- ной палочкой.

Добавляют 10 мкл 10%-ного глутарово- го альдегида с быстрым распределением его на поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при +4°С в течение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной. Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2 - 7,4).

Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в

микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и 10 мкл 0,15 М раствора DL- «-аланина

Сенсорную часть электрода Кларка вводят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения Ог, выражаемой в нМ поглощенного Ог в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой зависимости скорости поглощения Оз при окислении L-лактата.

Время формирования сигнала составляет 2,9 - 4,1 с , время возвращения сигнала на базовый уровень при отмывке электрода от метаболитов 3 - 5 с. Электрод может храниться до 2 мес при +4°С.

Формула изобретения Способ определения молочной кислоты, заключающийся в регистрации поглоще- ния кислорода при окислении анализируемой смеси, содержащей молочную кислоту, иммобилизованным ферментным реагентом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, в качестве ферментного реагента используют клетки Aerococcus vlridans ВНИИА, 1688, окисляющие О- и L-изомеры молочной кислоты, а в анализируемую смесь добавляют равный объем 0,05 - 0,15 М раствора DL- а-аланина.

Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения метаболитов с помощью ферментных электродов Цель изобретения - повышение чувствительности. Способ заключается в том, что в качестве ферментного сенсора используют кислородный электрод с иммобилизованными клетками аэрококков Aerococcus virldans ВНИИА 1688(167 VR)c повышенной способностью окисления молочной кислоты Скоростьпоглощениякислорода дополнительно усиливается с помощью введения в реакционную смесь 0,1 М D-L-tt-ала- нина. Объем анализируемой пробы 20 мкл, чувствительность способа 0,1 мкМ. время формирования сигнала 2,9 - 4.1 с, время возвращения сигнала на базовый уровень при отмывке электрода от метаболитов 3-5 с, интервал линейности калибровочного графика 0,5 - 5 мкм. Электрод стабилен в течение 2 мес при хранении при 4°С. 2 табл. 1 ил. Ё

95,,2 155.7,2 529,143,2

622,3125

Таблица 1

502,,2 59Г.18,8

.

1дпП02

Таблиц

/1актот,м/1

т- 7

т 9

-г- 10