Способ электрохимического определения глюкозы и электрод для его осуществления Советский патент 1985 года по МПК G01N27/42 

г Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине для определения концентрации глюкозы. Цель изобретения увеличение чувствительности способа. Пример 1. Определение глю-козы на электроде, модифицированном сажей. Стеклоуглеродный электрод с рабо чей поверхностью 0,1 см получают путем нанесения на его поверхность 1 мг пасты из сажи марки ПМ-105 и воды (1:2 по весу). Затем на электрод наносят 10 мкл раствора глюкозооксидазы (60 мкМ), наверх надевшрт диализную мембрану и закрепляю ее резиновым кольцом. Далее электрод погружают в 0,1 М фосфатньй буфер рН 7,0 в электролизной ячейке и задают ему потенциал 0,0 В отноои тельно Ag/AgCl электрода сравнения. После 10 мин вводят 10 или 20 шсМ глюкозы и проводят накопление в течение 1,5-8 мин. По истечении этого времени биполярным ключом включают потенциал 0,4 В и определяют количе ство накопленного электричества в течение 10 с. В табл. 1 приведены данные завис мости накопленного электричества от времени накопления при определении глюкозы (рП 7,0; 0,1 М фосфатный буфер). Таблица 712 руют путем адсорбцш из 052%-ного водного -раствора редокс полимера поливинилпиримидина,, кватернизованного 2-бромбензохиноном в течение 5 мин. Затем электрод промывают водой, на его поверхность наносят 10 мкл раствора гл окозооксидазы (60 мкМ), наверх надевают диалР1зную мембрану, которую закрепляют резиновым кольцом. Электрод погружают в 0,1 М фосфатньй буфер (рН 7,0) в Электролизной ячейке и задают потенциал 0,03 В относительно Ag/AgCl электрода сравнения,После 10 мин вводят 20-200 мМ (ин-гервал концентраций для построения калибровочного графика) глюкозы и проводят накопление в течение 1,5 или 4 мин. По истечении этого времени биполярным клю-чом 2 включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 30 с. Данные определения глюкозы (рН 7,05 0,1 М фосфатньй буферный раствор) приведены в табл. 2. Таблица 2

1. Способ электрохимического определения глюкозы, заключающийся в наложении потенциала на ф ерментньй электрод, отличаю14ийся. тем, что, с целью повышения чувствительности, перед наложением потенциала ферментный электрод выдерживают в анализируемом растворе при 7,0 рН 6 7,5 в течение 1,5-12 мин, после чего измеряют количество электричества, пропорциональное содержанию глюкозы. 2.Электрод для электрохимического определения глюкозы, содержащий токопроводящий слой, соединенньй с токоотводом и ферментньй слой, отличающийся тем, что, с целью, повышения чувствительности определения, электрод допо тшительно снабжен слоем сажевой пасты, размещенным меж ду токопроводящим и ферментным слоя(О ми. 3.Электрод по п.2, отличающийся тем, что токопроводящий слой выполнен из комплекса N-метилфеназиния и тетрадиано-п-хинодимета; на.

р и М е р 2. Определение глюкозы на электроде, модифицирован- 55 и

ном редокс полимером.

Стеклоу глеродный электрод с поверхностью О,1 см модифициИз табл. 2 видно, что при времени накопления 1,5 или 4 мин график определения глюкозы линеен до 110

дел определения метаболита составляет 20 мкМ. Электрод сохраняет работоспособность 5 дн« 70 мкМ соответственно. Нижний npe 3 Пример 3. Определение накоп ления элекуричества глюкозы в зависимости от времени и степени модификации электрода редокс полимером. Стеклоуглеродный электрод с рабочей поверхностью 0,1 см модифицируют путем адсорбции из 0,2%-ного этапольного раствора полигидрохлорида в течение 2 или 5 мин. Затем электрод промывают этанолом и водой, погружают в 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0) и путем записи циклической вольтамперограммы определяют степень модификации электрода редокс группами, составляющую 0,3 и 0,5 нмоль-см соответственно. Затем на поверхность электрода наносят 10 мкл раствора глюкозооксидазы (60 мкМ), покрывают диализной мембраной, которую закрепляют резиновым кольцом. Электроду задают потенциал 0,0 В относительно Ag/AgCl электрода сравнения. После 10 мин вводят 80 мкМ глюкозы и прово дят накопление в течение 1,5; 3; 5; 8; 12 мин. По истечении этого времени биполярным кольцом 2 включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 30 с. Данные зависимости количества накопленного электричества глюкозы от времени и степени модификации электрода (концентрация глюкозы 80 мкМ в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, t 25 с) приведены в табл. 3. Таблица 3

Из приведенных данных видно, что предельная величина накопленного 71 электричества достигается при времени накопления более 12 мин. Количество накопленного электричества увеличивается с увеличением степени модификации электрода редокс полимером. Пример 4. Определение глюкозы на электроде из токопроводящего органического комплекса. Электрод, полученный путем прессования токопроводящего комплекса тетрациано-п-хинодиметана и N-метилфеназиния, с рабочей поверхностью 0,3 см , содержащий под диализной мембраной 10 мкм раствора глюкозооксидазы (60 мкМ), погружают в 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0) в электролизной ячейке. Электроду задают потенциал 0,3 В относительно Ag/AgCl электрода сравнения и вьщерживают 10 мин. После этого вводят 10200 мкМ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) глюкозы и проводят накопление в течение 5-10 мин. По истечении этого времени биполярным ключом включают потенциал 0,0 В и в течение 60 с определяют количество накопленного электричества. Данные зависимости накопленного электричества при определении глюкозы (рН 7,0; 0,1 М фосфатный буфер) приведены в табл. 4. Таблица 4

Продолжение табл. 4 Из приведенных данных видно, что количество накопленного электричества с использованием токопроводящих комплексов пропорционально количеству глюкозы и времени накопления. Нижний предел определения метаболита составляет 10 мкМ. Пример 5. Определение глюкозы в крови. Исследования проводят аналогично примеру 4 за исключением введения 0,1 мл десятикратно разбавленной буферным раствором крови человека вмес то раствора глюкозы в электрохимичес кую ячейку объемом 5 мл. При времени накопления 10 мин количество накопленного электричества составляет 2,35 мкКл. Концентрация глюкозы в крови, рассчитанная на основе калибровочного графика, составляет (с учетом разбавлений) 5,1 мМ(91,9 мг.% что близко физиологическому уровню метаболита (80-100 мг.%). Пример 6. Определение концентрации лактата. Графитовый электрод с рабочей площадью электрода 0,15 см погружают в 9,2 мкМ раствора цитохрома В в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0) в течение 2 ч. Потом электрод отмывают тем же буфером и погружают в 2 мл буферного раствора в электролизной ячейке. На электрод задают потенциал величиной 0,2 В относитель но Ag/AgCl электрода сравнения. После 10 мин вводят 10 ,004-; 0,2 мМ L-лактата (интервагГконцентрации для построения калибровочного графика) и проводят накопление в течение 5 или 20 мин. По истечении это го времени биполярным ключом 2 включают потенциал 0,2 В и определяют количество накопленного электричест,ва в течение 2с. Данные определения лактата (рН 7, 0,1 М фосфатный буферный растворt 25С) приведены в табл. 5. Из приведенных данных строится калибровочньй график зависимости количества накопленного электричества от концентрации L-лактата в ячейке.

Таблица 5 Калибровочный график определения лактата линеен до 0,16 и 0,44 мкМ при 5 и 20 мин накопления. Нижний предел определения метаболита составляет 0,020 (5 мин накопления) или 0,032 мкМ (20 мин накопления). Электрод сохраняет работоспособность в тетечение 7 дн. Пример 7. Определение лактата в слюне. Аналогично примеру 6 за исключением введения 10 мкл десятикратно разбавленной буферным раствором слюны вместо раствора лактата. При времени накопления 20 мин количество накопленного электричества составляет 5,9; 6,4 и 7,5 мкКл для разных образцов. Концентрация молочной кислоты в слюне, рассчитанная на основе калибровочного графика, составляет 0,59; 0,64 и 0,76 мМ, что близко физиологическому уровню метаболита (7,4 мг.% по известным данным). Пример 8. Определение концентрации Н,0,. На поверхность графитового ;Электрода, импрегнированного парафи7

ном (0,018 см) наносят Ю мкл раствора дероксидазы растительного происхождения (10 мкМ) в 0,1 М фосфатцитратном буфере (рН 5,2). Раствор фиксируют на поверхности при помощи диализной мембраны, закрепляемой на корпусе электрода резиновым кольцом Электрод погружают в электрохимическую ячейку, содержащую 25 мл М фосфат-цитратного буфера:, рН 5,2, t , задают потенциал 0,4 В относительно Ag/AgCl электрода сравнения, и вьщерживают при нем 10 мин. После этого в ячейку вводят 0,2 мл 0,63-3,78 мМ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) раствор перекиси водорода в том же буферном растворе и проводят накопление электричества в течение 1 или 2 мин (в реакционной смеси из-за разбавления концентрации составляет 5-30 мкМ). По истечении времени накопления биполярным ключом включают потенциал 0,0 В и определяют количество накопленного электричества в течение 2 с с задержкой начала измерения 120 мс.

Данные определения (рН 5,2; 0,1 М фосфат-цитратный буферный раствор, t ) приведены в табл. 6

180771

Таблица 6

Из приведенных данньгх видно, что при времени накопления 1 или 2 мин калибровочные графики определения перекипи водорода линейны до 30 . Нижний предел определения И202 5 мкМ. Электрод сохраняет работоспособность в течение месяца при 4 С.