Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI для получения рибавирина Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 

Чи

Ё

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству противовирусных соединений, и касается нового штамма бактерий, используемого для получения рибавирина. Целью изобретения является новый, экспериментально полученный, штамм бактерии ESCHERICHIA COLI ВКПМ В-4834 с повышенной активностью клеток в реакции синтеза рибавирина. Рибавиринсинтезирующую активность измеряют путем прямого определения количества рибавирина, образующегося при инкубации сырой биомассы клеток с изанозином и ТК.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству противовирусных соединений.

Целью изобретения является новый экспериментально полученный штамм бактерии Escherichla coll БМТ-ЗД/1А с повышенной активностью клеток в реакции синтеза рибавирина, в связи с чем его используют для получения этого противовирусного нуклеозида.

Штамм E.coll БМТ-ЗД/1А получен из музейного тиминзависимого штамма E.coli п 3110 путем отбора наиболее активных вариантов при последовательном выращивании на плотной агаризованной среде АдамСа с тимином (1 мкг/мл), затем с тими- нарабинозидом (5 мкг/мл) в качестве источ- ника тимина и наконец на среде, содержащей тимин (1 мкг/мл) и гуанозин (1 мг/мл) в качестве источника углерода.

Штамм E.coli БМТ-ЗД/1А депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ В- 4834 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Под микроскопом клетки имеют вид прямых палочек с закругленными концами (1,1-1,5)х(2-6) мкм. Встречаются отдельно или парами. Спор и капсул не образуют. Клетки обладают подвижностью. По типу движения - перитрихи. Грамотрицатель- ные.

В бульоне Хоттингера к 24 ч (37° С) рост выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается при встряхивании (S-форма).

На МПА и агаризованной среде Адамса (37° С, 3 сут) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Консистенция вязО

о

k

ю о ю

кая. Цвет колоний сероватый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые.

На агаризованной дифференциальной среде Эндо штамм растет в виде полупрозрачных колоний без изменения цвета среды.

Диапазон температуры роста 7-40° С. Оптимальная температура 36-37° С.

Диапазон рН роста 5,5-8,5. Оптимум роста наблюдается при рН среды 7-7,5. Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. В процессе роста сбраживает до кислоты с незначительным выделением газа глюкозу, араби- нозу, трегалозу, мальтозу, маннит, глицерин. Не усваивает сахарозу, лактозу, оафинозу сорбит, дульцит.

В качестве единственного источника углерода может использовать ацетат, но не цитрат и инозит.

Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. Молоко не свертывает. Гидролизует РНК.

Гемолитическими свойствами не облагает Не токсичен и не патогенен для теплокровных животных,

Усваивает аммонийный и нитратный азот. Наиболее активный рост биомассы обеспечивают органические источники азота (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты, ферментолизат БВК).

Продуцирует индол, каталазу. Не образует уреазу и оксидазу. Содержание Г+Ц в составе ДНК 50,3±0,5 мол.% (определено оптическим методом).

Штамм нетоксичен и непатогенен для теплокровных животных.

Культура сохраняет жизнеспособность не менее года при хранении в холодильнике (4° С) на полноценной агаризованной среде (МПА, среза Хоттингера) под слоем вазелинового масла, а также в лиофильно- высушенном состоянии.

Штамм E.coli БМТ-ЗД/1Аслособен синтезировать рибавирин с эффективностью 1,05 ммоль/ч/r клеток (в расчете на сухую массу).

Рибавиринсинтезирующую активность измеряют путем прямого определения количества рибавирина, образующегося при инкубации сырой биомассы клеток с гуано- зином и ТК. С этой целью реакционную смесь (1 мл), содержащую 10 мМ К-фосфат- ный буфер (рН 7), 15 кг клеток, гуанозин и ТК в концентрациях 0,3 М, инкубируют при 60° С в течение В ч. После инкубации реакционную смесь центрифугируют (SOOOg, 10 мин)

и надосадочную жидкость хроматографиру; ют на тонкослойной пластинке Silufol . UV254 (Kavalier, ЧССР) в системе растворителей изопропано-хлороформ -25% водный

аммиак (10:5:2). Целевой продукт обнаружен в УФ-свете, идентифицируя сравнением с положением образца-свидетеля, и элюируют водой. После внесения в элюат фосфатного буфера (рН 7) его оптическую

0 плотность замеряют на спектрофотометре.

Концентрацию рибавирина рассчитывают,

используя коэффициент молярной экстинции при длине волны 207 нм, равный 11600.

В таблице дана сравнительная оценка

5 эффективности наиболее активных из 80 проверенных штаммов микроорганизмов.

П р и м е р 1. Культуру штамма E.coli БМТ-ЗД/1А вносят петлей с косяка в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл МАБ с

0 0,5%-ным дрожжевым экстрактом и 0,5% NaCI, культивируют на биологической качалке (180 об/мин) в течение 16 ч при 37° С. Приготовленным посевным материалом в количестве 5% засевают лабораторный фер5 ментер АК-3 емкостью 3 л, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Ферментацию ведут 12 ч при 37° С с аэрацией 0,8 л/мин на 1 л среды.

По окончании культивирования клетки

0 собирают центрифугированием (SOOOg, 10 мин), получая 3,5 г клеток (в расчете на сухую массу) с рибавиринсинте- зирующей активностью 1 ммоль рибавири- на/ч/г.

5П ри м е р2. Клетки E.coli БМТ-ЗД/1А,

выросшие в двух 250 мл колбах, согласно примеру 1, используют в качестве посевного материала и засевают ими лабораторный ферментер АК-3 емкостью 3 л, содержащий

0 2 л питательной среды следующего состава, г/л: 6 Na2HPO i; 3 КН2Р04,- 0,5 NaCI; 1 МЩС1; 0,125 MgS04x 7H20; 40 ферментализат БВК. Начальное значение рН 7,5. Ферментацию ведут 12 ч при 37° С и аэрацией 0,8 л/мин

5 на 1 л среды.

По окончании культивирования клетки

собирают центрифугированием

(8000д, 10 мин), получая 8 г клеток (в рас- чете на сухую массу) с рибавиринсинтезиру0 ющей активностью 1,05 ммоль/ч/г сухой массы.

10 мл смеси, содержащей 0,3 М ТК, 0,3 М гуанозина, 10 мМ К-фосфатный буфер (рН 7), инкубируют с перемешиванием 30 ч при

5 60° С. После осаждения клеток центрифугированием (SOOOg, 10 мин) их дважды промывают 10 мл воды. Супернатанты объединяют и наносят на колонку (2,5x4 см) с ионообменной смолой Dowex 50w x 8 в Н+-форме. Ко- лонку промывают водой. Фракции,

содержащие рибавирин (200 мл), объединяют и наносят на колонку (1,15x4 см) с ионообменной смолой Dowex 1x8 в ОН-форме. Промывая колонку водой, получают раствор рибавирина (340 мл), который упаривают до объема 6 мл, прибавляют 30 мл этанола и упаривают досуха. Остаток растворяют в 5 мл этанола при нагревании с обратным холодильником на водяной бане. После кристаллизации на холоде рибавирин собирают на стеклянном фильтре и сушат до постоянной массы при 60° С в течение 18ч в суховоздушном шкафу. Получено 0,491 г хроматографически чистого целевого продукта, что соответствует выходу 67% от теоретически возможного.

При хроматографировании на тонко- слойных пластинках Silufol-UV254 в системах растворителей изопропанол-хло- роформ - 25% аммиак (10:5:2) и н-бутанол - 25% аммиак (7:2) подвижность целевого

Штамм микроорганизмов

Рибавиринсинтезирующая

активность, ммоль/ч/r сухой

массы

Е. coll БМТ-ЗД/IA

E.coll 3110

Е. coll БМ-11

E.coll ВКПМ В-4109

Е. coli БМТ-2Д/1А E.coll ЦМПМ В-2752 Erwlnla herblcola ЦМПМ В-3275 Erwlnia herbicola БМ-47/3

Примечание. Относительная эффективность других штаммов не превышает 10 %.

продукта совпадает с Rf контрольного пре- парата рибавирина.

Т.пл. целевого продукта 163-166° С. Элементный анализ для , М 244.

Найдено, %: С 39.85; Н 4,99: N 22,70. Вычислено. %: С 39,34; Н 4,95; N 22,94. 1н-ЯМР(ДМСО - de),7M.g. от ТМС: 8,87 с (1Н, Н-5); 7,82 с (1Н. KlH2); 7,62 с (1Н,

CONH2);5,82fl(1H,H-l ,j1 A 3,6 Гц); 5,55 уш.с(1Н.ОН-2 ). 5.17 уш.сПН.ОН-З ); 4,90

уш.с(1Н, ОН-5 );4,37дд(1Н, Н-2 . Л , 3

4,8 Гц);4.17дд(1Н, Н-31 , Л, I 4.8 Гц);

3,97 м (1 Н, Н-4 ); 3.63 дд(1Н. Н-5 ,Л. I

3,6 Гц. J;, 5 12 Гц);3,52дд(1Н.Н-5 .

Js . 4 4,8 Гц).

Формула изобретения Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ-В-4834 для получения рибавирина.

Относительная эффективность. %

100 28,6 14.3 10,5

19 21,9

13,3 10.5