Способ размножения растений ячменя IN VIтRо Советский патент 1991 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности биологических исследований растений методом культуры изолированных тканей, и является усовершенствованием способа по авт.св. N°. 1161024.

Целью изобретения является увеличение выхода каллусов с высокой регенерационной способностью.

Способ состоит в том, что при получении и субкультивировании каллусов НС-типа с хлорофиллосодержащими клетками на питательной среде с последующей регенерацией растений,получение и субкультивирование каллусов НС-типа с хлорофиллсодержащими клетками проводят в фитокамере при относительной влажности воздуха 30-50%.

Пример 1. В исследования вовлечен сорт ячменя Олимп.

В качестве эксплантатов для получения каллусной культуры используют зародыши зрелых семян. Предварительно зародыши освобождают от пленок. Семена стерилизуют сначала в 70%-ном этиловом спирте в течение 10 мин, затем - в 0,1 %-ном растворе сулемы в течение 10 мин. Простерилизованные семена промывают 6-кратно по 5 мин стерильной водой.

Верхние половинки зародышей (160- 200 в каждом варианте) сажают на агари- зованную питательную среду (на модифицированную среду Bs) перпендикулярно к поверхности среды срезом вниз.

Состав среды рН 5,5 следующий, мг/л:

СП

с

КЫОз

NaH2P04 Н20 (NH4)aS04 MgS04 7Н20 CaCI2 2Н20 FeS04 7Н20 N32-EDTA 2Н20 НзВОз

MnS04 Н20 ZnS047Н20 Na2Mo04 2Н20 CuSO4 5Н20 СоС12 6Н20 KJ

Витамин Bi Витамин Be Никотиновая кислота Мезоинозит

2500 150 134 250 150 27,8 37,3 3,0 10,0 2,0 0,25 0,25 0,025 0,75 10.0 1,0 1,0 100

о о

4 00

N О

ю

2,4-Д5,0

Сахароза20000

Агар-агар8000

Культивирование эксплантатов и субкультивирование полученных каллусов про- водят при 16-часовом фотопериоде, освещенности 1000-1500 лк, температуре 23-25°С в пробирках, содержащих по 25 мл питательной среды, закрытых ватно-марле- выми пробками. При этом в фитокамере относительную влажность воздуха поддерживают на уровне 30-50%.

При культивировании эксплантатов выделяются каллусы,обозначенные как каллусы НС-типа. НС-каллусы образуют обычно агрегаты, состоящие из плотных сегментов лопастной формы белого или желтоватого цвета с участками зеленого цвета или без них.

Первичные НС-каллусы выделяются че- рез 90-120 дней. В дальнейшем при субкультивировании пересадки на свежую среду делают через 45-60 дней. При пересадках для дальнейшего культивирования вычленяют комочки НС-каллусов с хлоро- филлсодержащими клетками размером 4-6 мм. Таким путем происходит отбор форм с высокой регенерационной способностью. При этом регенерационная способность культур до 2-3 лет сохранялась на уровне 70-80%.

При получении и субкультивировании каллусов в фитокамере при относительной влажности воздуха 30-50% достигается оптимизация условий для формирования кал- лусов НС-типа с хлорофиллсодержащими клетками. Предполагается, что этот эффект связан с транспирацией. Видимо, происходящая с определенной при данных условиях интенсивностью транспирация способству- ет созданию в каллусах необходимого градиента каллусогенных веществ.

Примеры 2иЗ. Получение культуры проводят аналогично примеру 1, но исследуют размножение in vitro при использова- нии предлагаемого способа у сортов ячменя Целинный-5 и Одесский-100,

Зависимость формирования НС-каллусов с хлорофиллсодерхощими клетками от относительной влажности воздуха в фитока- мере у различных сортов представлена в таблице.

Число оцениваемых культуральных пробирок в каждом варианте 100-120.

Для получения растений-регенерантов НС-каллусы с хлорофиллсодержащими клетками пересаживают на агаризованную питательную среду, например на среду Bs без2,04-Д,и выращивают их при 16-часовом

фотопериоде, освещенности 3000-5000 лк, температуре 16-18°С ночью и 23-25°С днем.

Растения-регенеранты размером 10- 15 см пересаживают в сосуды с почвой и выращивают в фитокамерах до полного созревания семян при 16-часовом фотопериоде, освещенности 20000-2500000 лк, температуре 16-18°С ночью, 23-25°С днем.

За 5-7 дней до пересадки в почву растений-регенерантов для постепенной адаптации их к новым условиям с пробирок снимают ватно-марлевые пробки.

При пересадке, чтобы меньше повредить корневую систему растений, используют приспособление для выталкивания из пробирок агаровых блоков вместе с расте- ниями-регенерантами, Это приспособление представляет собой шланг, один конец которого соединен с металлической трубкой - иглой диаметром 3 мм, длиной 250 мм, а другой конец подсоединяется к водопроводу. Трубку-иглу проводят через араговый слой до дна пробирки, и давление воды выталкивает агаровый блок вместе с растеньицами. Затем растения-регенеранты отмывают водопроводной водой от агара и сажают в сосуды с почвой.

Всего получено более 2000 растений- регенерантов.

Изучение растений-регенерантов и их потомства показывает наличие широкого спектра изменчивости. Генетическая изменчивость наблюдается по таким хозяйственно-ценным признакам как продуктивность, высота растений, темпы развития и т.д., что дает возможность использовать растения- регенеранты в селекции для отбора форм с новыми хозяйственно-ценными свойствами.

Применение способа позволяет увеличить выход каллусов ячменя с высокой ре- генерациоНной способностью посредством оптимизации условий для формирования НС-каллусов с хлорофиллсодержащими клетками и повысить эффективность использования культуры тканей ячменя в селекционном процессе для получения новых хозяйственно-ценных форм.

Формула изобретения Способ размножения растений ячменя in vitro по авт.св. № 1161024, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода каллусов с высокой регенерационной способностью, получение и субкультивирование каллусов НС-типа проводят в фитокамере при относительной влажности воздуха 30-50%.

Кратное увеличение после каждой пересадки (через 45 дней)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию растительных тканей и клеток. Целью изобретения является увеличение выхода каллусов с высокой регенерационной способностью. Способ состоит в том, что каллусы НС-типа получают и культивируют в фитокамере при относительной влажности воздуха 30 - 50%. 1 табл.