Способ диагностики заболеваний растений, вызванных РSеUDомоNаS SYRINGae 1у серогруппы Советский патент 1991 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к иммунохимическим методам экспресс- диагностики фитозаболеваний, вызванных Pseudomonas syringae

Цель изобретения - ускорение диагностики заболевания.

Способ диагностики заболеваний растений, вызванных Pseudomonas syringae IV серогруппы, заключается в следующем.

На предметном стекле смешивают 0,05 мл водносолевою экстракта исследуемого растительного материала и 0,025 мл реагента для диапностики P.syringae IV серогруппы который предварительно готовят из-антисыворотки к Оспецифическому

агеьту Pw er nggr Х|Тамг РГЗ и суспензии клеток Staphylococcus штэмм Cowan-1. взятых в соотношении i.5- 1 50. О наличии фитопатогенных бактерий P.syringae IV серогруппы судят по прохождению через 30-60 с реакции агглютинации

Пример 1. отучение имуннсй сыворотки к экзоцепгюрярному 0-антигену Р wieringae7923.

Для получения специфической энти- сыворотки кроликов иммунизируют экэо- целлюлярным 0-специфическ1 полиса харидом (ЭОПС). В препарат ЭОПС обнаружено 56% углеводов, менее 1% белка

Кроликов иммунизируют ЭОПС P.wieringae 7923 по комбинированной схеО

VI

сх ю VI

CJ

ме с интервалом между инъекциями 2 недели.

Iвведение - вунтримышечно 2 мг ЭОПС в 0,5 мл изотонического раствора NaCI и 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда.

IIвведение - внутримышечно 5 мг ЭОПС в 0,5 мл изотонического раствора NaCI и 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда.

IIIвведение внутривенно 2,5 мг ЭОПС в 1 мл изотонического раствора NaCI.

IVвведение - внутривенно 3 мг ЭОПС в 1 мл изотонического раствора NaCI. Кровь брали на 8-14-й день после последней инъекции. Антисыворотка к ЭОПС агглюти- нировала гомологичную культуру в разведении 1:50000.

Пример 2. Способ получения реагента.

Реагент для экспресс-диагностики бак- терий P.syrlngae IV серогруппы получают сенсибилизацией клеток Staphylococcus aureus штамм Cowan-1, содержащих белок А, специфической иммунной сывороткой к экзоцеллюлярному 0-антигену P.wierlngae 7923. Для этого 0,1 мл нативной иммунной сыворотки инкубируют с 1 мл 10%-ной стафилококковой суспензии из клеток, полученных при 18-часовом культивировании на мясопептонном агаре, отмывают от не- присоединившихся к белку А антител в течение 10-15 мин при центрифугировании при 3 тыс. об/мин. Осадок, представляющий собой белок А-содержащие корпускулы стафилококка, обработанные иммуноглобу- линами к экзоцеллюлярному 0-антигену P.wierlngae 7923, суспендируют в 10 мл физиологического раствора: полученная суспензия является готовым реагентом для определения антигенов P.syringae IV серо- группы, способным храниться без потери активности при +4°С в течение 2 месяцев. .Реагент обладает высокой специфичностью в отношении антигенов P.syringae IV серогруппы (табл.1).

Пример 3. Применение реагента для обнаружения фитопатогенных бактерий P.syringae IV серогруппы.

Представителями IV серогруппы фитопатогенных P.syringae 2846 и 4394 и P.wierlngae 7923 проводят искусственное заражение пшеницы, фасоли, конских бобов, перца, табака. Из образцов искусственно зараженных растений готовят водно- солевые экстракты путем измельчения растительной массы и экстракцией физиологическим раствором с последующим фильтрованием.

Реакции осуществляют на предметном стекле: к 0,025 мл реагента добавляют 0,05 мл растительного экстракта. В течение 30-60 с производят учет реакции на наличие агглютинатов (табл.2).

Пример 4. Сравнение предлагаемого технического решения с известным.

Для проведения реакции агглютинации используют сыворотку, полученную аналогично описанной в примере 1, и реагент по примеру 2. Реакцию осуществляют с чистыми культурами указанных фитопатогенных бактерий.

Полученные результаты представлены е табл.3.

Пример 5. Исследована зависимость чувствительности реакции от концентрации стафилококковой суспензии при приготовлении реагента и концентрации сыворотки при приготовлении реагента.

Данные приведены в табл.4 и 5.

Как видно из табл.4, для приготовления реагента для осуществления способа экспресс-диагностики заболеваний растений, вызванных P.syringae IV серогруппы, можно использовать 5-15%-ную взвесь стафилококка. При использовании 15%-ной взвеси вследствие большой густоты затрудняется учет реакции. Сравнивая результаты реакции с использованием 5-15%-ной взвеси стафилококка, можно сделать вывод, что наиболее целесообразно использовать 10% ную взвесь.

Как видно из табл.5, оптимальным является соотношение сыворотки и взвеси стафилококка 1:10.

Способ позволяет ускорить время проведения реакции и уменьшить расход сыворотки на каждый анализ.

Формула изобретения Способ диагностики заболевания растений, вызванных Pseudomonas syrlngae IV серогруппы, включающий нанесение на предметное стекло экстракта исследуемых растений с последующим проведением серологической реакции со специфическим антителосодержащим реагентом и учетом результатов, отличающийся тем, что, с целью ускорения диагностики заболевания, в качестве реагента используют сыворотку к 0-специфическому антигену Pseudomonas wieringae 7923, адсорбированную на клетках Staphylococcus aureus Cowan-1.

Таблица 1 Специфичность реагента для экспресс-обнаружения P.syrlngae IVceporpynnu

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к иммунохимическим методам экспресс-диагностики фитозаболеваний, вызванных PSCUDOMONAS SYRINGAC. Цель изобретения - ускорение диагностики заболевания. Способ диагностики заболеваний растений, вызванныхР. SYRINGAC IV серогруппы заключается в следующем. На предметном стекле смешивают 0,05 мл водносолевого экстракта исследуемого растительного материала и 0,025 мл реагента для диагностики P. SYRINGAC IV серогруппы, который предварительно готовят из антисыворотки к О-специфическому антигену P. WIERINGAC штамм 7923 и 10%-ной суспензии клеток STAPHYLOCOCCUS AUREUS штамм COWAN - 1, взятых в соотношении 1:5 - 1:50. О наличии фитопатогенных бактерий P. SYRINGAL IV серогруппы судят через 30 - 60 с реакции агглютинации. Способ позволяет ускорить время проведения реакции и уменьшить расход сыворотки на каждый анализ. 5 табл.

Вид

P.syringae, 2846 P.syrlngae 4394 P.wieringae. 7923

E. coll

P. aeruglnosa

P. cichorll 9048

P. gladioli pv allllcola

Выявление возбудителя в экстрактах зараженных растений

Вид растений

Штамм, используемый для заражения

Перец P.syrlngae P.syrlngae P.wieringae

Ко нтроль-неинфициро ванное растение перца Табак P.syringae P.syringae P.wieringae

Ко нтроль-неинфициро ванное растение табака Конские бобььP.syringae P.syrlngae P.wieringae

Контроль-неинфицированное растение конских бобов Пшеница P.syringae P.syringae P.wieringae

Контроль-неинфицированное растение пшеницы Фасоль P.syringae P.syringae P.wieringae

Контроль-неинфицированное растение фасоли

Таблица 3 Сравнение способов с применением реагента и нативной сыворотки

Результат реакции

++++ ++++

-H-f+

Таблица 2

Результат реакции

+-Н-+ ++++ ++++

++++ ++++ ++++

+ -++

+++4 -М-++

4-4-4-4- 4-1-4-4- ++++

++++ ++++ -М-+4

Зависимость чувствительности реакции от концентрации стафилококковой суспензии при приготовлении реагента

Зависимость чувствительности реакции от концентрации сыворотки при приготовлении реагента

Таблица 4

Таблица 5