Иммобилизованная аденилатциклаза чумного микроба Советский патент 1993 года по МПК C12N11/12 C12N9/88 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения матриц с ковалентно связанными белками.

Цель изобретения - иммобилизация аденилатциклазы чумного микроба.

. Цель достигается тем, что на окислзн- ной с помощью периодата сефарозе CL 6B ковалентно связывают аденилатциклазу чумного микроба. В отличие от прототипа раствор для присоединения фермента не содержит фосфатных ионов, инактивирующих аденилатциклазу.

Пример 1. 1,5 г сефарозы CL 6B, промытой 10-кратным объемом воды, помещают в пластиковый флакон объемом 15-20 мл. Добавляют 3 мл 0,07 М раствора периодата натрия и медленно перемешивают реакционную смесь в течение 45-60 мин при комнатной температуре. Добавляют 0,5 мл 2 М этиленгликоля и продолжают перемешивание еще 30 минут. Гель отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре,

промывают водой, а затем 0,01 М натрий- карбонатным буфером (рН 9,5).

В 5 мл отдиализованного против 0,01 М карбонатного буфера (рН 8.5) раствора аденилатциклазы чумного микроба (0,5 мг/мл аденилатциклазы с активностью 2 нмоль/мг) вносят активированную матрицу и рН суспензии доводят до 9,5 с помощью 2 М гидроокиси натрия. Реакцию продолжают в течение 24 часов, медленно вращал реакционный сосуд при 8-10°С.

Для восстановления азометинов и оставшихся альдегидных групп добавляют 3 мл свежеприготовленного раствора боро- гидрида натрия в концентрации 1 мг/мл в том же буфере. Реакцию продолжают при медленном перемешивании в течение 1 часа в холодном помещении. Гель промывают 0,01 М карбонатным буфером рН 8,5, затем 0,01 Мтрис-HCI рН 7,6. Активность связанной с матрицей аденилатциклазы определяют по методу (Tovey K.S., Whelan J.A.M. A simple direct assay for cyclic AMP in plasma and other biological sampe using an improved

(Л

CO 00 b

GO

ompletive protelin binding technique. Clin. hlm. Acta, 1974, v.56, P.221-224). Ома сотавляет 2,5 ед/г. За единицу активности денилатциклазы принимают количество аномелей цАМФ синтезированного одним г фермента за 1- минуту при 37°С. Количетво аденилатциклазы, иммобилизованной на 1 г носителя равно 1,3 мг, что составляет 80% от добавленной для связывания. Иммобилизованный фермент сохраняет 95% акивности по отношению к нативному состоянию, Иммобилизованная аденилат- циклаза полностью сохраняла свою активность в течение 6 месяцев (срок наблюдения).

Пример 2. Все операции проводят как в примере 1, но концентрация аденилатциклазы составляет 0,6 мг/мл, инкубация 12 часов, температура 22°С. Дальнейшие операции как в примере 1. Количество адени- латцмклазы иммобилизованной на 1 г носителя составляет 1,7 мг, что соответствует 85% от добавленной для связывания. Активность связанной с матрицей аденилатциклазы соответствует 3,2 ед/г.

Пример 3. Все операции проводят как в примере 1, но аденилатциклазу отдиа- лизовывают против 0,01 М карбонатного буфера рН 9,5. Концентрация фермента составляет 0,5 мг/мл, время инкубации 10 часов, температура 28°С. Количество аденилатциклазы иммобилизованной на 1 г носителя составляет 1,4 мг, что составляет 82% от добавленной для связывания. Активность связанной с матрицей аденилатциклазы составляет 2,7 ед/г.

Как видно из приведенных примеров,, полученная иммобилизованная аденилат- циклзза чумного микроба является высокоактивным и стабильным продуктом, имеющим большую биотехнологическую и биохимическую значиморть. Поскольку аденилатциклаза является ферментом синтеза циклического аденозинмонофосфата - биологически активного вещества, используемого в биологии и медицине, то

иммобилизованная форма фермента может быть использована в биотехнологическом процессе по получению цАМФ, благодаря легкой извлекаемое™ нуклеотида из реакционной смеси и возможности многократного использования матрицы, Кроме того, связанная аденилатциклзза характеризуется стабильностью своей структуры, что обус- ловливаетвозможность ее

транспортировки на большие расстояния без привлечения низкой температуры и других условий, обычно используемых для ферментов.

Ковалентноё связывание аденилатциклазы может сыграть свою роль в изучении механизма ее действия, т.к. дает возможность быстро изменять и контролировать окружение фермента. Если учесть, что большинство белков клетки, к числу которых относится аденилатциклаза, активируются присоединением или отщеплением неорганического фосфата, то, имея пришитый к матрице белок, последовательно вводя или удаляя изучаемые вещества из реакционной системы, можно точно, установить, какой именно ион катализирует его активность и какие энзимы клетки принимают в этом уча- стие.

Формула -и з обретения Иммобилизованная аденилатциклаза чумного микроба общей формулы

н и

P-C-N-E- . Мгде Р - остаток модифицированного перио- датным окислением сефарозы CL 6В,

Н - N-E остаток молекулы аденилатцикла- зы после восстановления борогидридом натрия,

обладающая способностью синтезировать циклический аденозинмонофосфат.

Использование: биохимия и биотехнология относится к получению матриц с кова- лентно связанными белками. Сущность изобретения: получают иммобилизованную аденилатциклазу чумного микроба путем ковалентного связывания аденилатциклазы с окисленной с помощью периодата сефаро- зой CL 6B. Активность иммобилизованного фермента по отношению к нативному 95%. Активность сохраняется в течение 6 мес.