Штамм бактерий РSеUDомоNаS Sp., разлагающий метилацетат Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12S3/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод аце- тальдегидного производства.

Цель изобретения - получение нового штамма микроорганизма, обладающего способностью разлагать метилацетат.

Метил ацетат (мети л о вы и эфир уксусной кислоты)-летучий, высокотоксичный синтетический поллютант, химически устойчивый при нормальных условиях. В литературе нет сведений о микробной деградации этого соединения.

Изобретение заключается в том, что выделен штамм Pseudomonas sp. 24 RA, разлагающий метилацетат. Предельная концентрация метилацетата, при которой наблюдается его полное разложение предлагаемым штаммом, 1 г/л. Штамм выделен

из сточных вод ацетальдегидного производства.

Штамм обладает карбоксилэстеразой и разлагает метилацетат, используя продукты его гидролиза - ацетат и при низких концентрациях (до 0,1 г/л) метанол в качестве источников углерода и энергии.

Культу рал ьно-морфологичес кие признаки. Клетки -бесцветные, подвижные палочки 0,5 - 0,7-1,3 - 1,7 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорообразующие, не имеющие сложных внутрицитоплазматических мембран, подобных метанотрофным бактериям. Не имеет простек. Размножается делением пополам. Колонии на МПА до 5 мм в диаметре, округлые, непрозрачные, с ровным краем, белые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция тестообразная.

о о со

Сд5 О

Среды для выращивания: мясопептон- нытй бульон (агар), синтетическая среда D (пример 1) с метилацетатом, глюкозо-карто- фельный агар.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, растет при 10-39°С, оптимум 28- 32°С. Оптимум рН 6,8-7,2, при рН 3.6 не растет. Флоуресцирующие пигменты, пио- ционин, каротиноиды не образует. Имеет оксидазу, каталазу, аргининдигидролазу. Нитраты восстанавливает в нитриты. Леван из сахарозы, ацетоин, индол, ацетилме- тилкарбонол не образует. Желатин, целлюлозу, поли-/ -оксибутират не разлагает, но гидролизует крахмал и твин-80. Поли- /3 -оксибутират внутриклеточно не накапливается. 01 -/ -оксибутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде.

Источниками углерода для роста служат: формиат, метанол или этанол при низких кон центрациях (до 0,1 г/л), метилацетат, этилацетат, этилформиат, бутилацетат, изо- пропанол, изобутанол, L-арабиноза, фруктоза, L-рамноза, D-рибоза, 0-ксилоза, глюкоза, сахароза, D-серин, ацетат, бетаин, саркозин, глицин, фумарат. сукцинат, а-кетоглутарат.

Среду с глюкозой подкисляют, газообразование отсутствует. Анаэробно не ферментирует глюкозу. Рост не обеспечивают формальдегид, метиламин, деметиламин, триметиламин, этиламин, трегалоза, /3 - аланин, L-серин, фенилаланин, DL-аргинин. глиоксилат, n-оксибензоат. м-оксибензоат, мезоинозит.

Не растет автотрофно в атмосфере СОа + Н2 + 02. В качестве источников азота использует соли аммония, нитраты, некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается.

Штамм обладает индуцибельной карбок- силэстеразой, катилизирующей гидролиз эфирной связи метилацетата с образованием метанола и ацетата. Ацетат ассимилируется через цикл трикарбоновых кислот и глиок- силатный шунт(изоцитратлиазу и малатсин- тазу). Метанол ассимилируется через сериновый путь Ci-метаболизма. Штамм не имеет метанолдегидрогеназы (ФМС, HAD), но обладает алкогольоксидазой, де- гидрогеназами формальдегида (НАД, GSH) и формиата (ФМС), оксипируватредукта- зой, серинглиоксилатаминотрансферазой, малатлиазой. фосфоенолпируваткарбокси- лазой.

Ключевые ферменты рибулозомонофос- фатного пути фиксации формальдегида{гек- сулозофосфатсинтеза) и цикла Кальвина

автотрофной фиксации углекислоты (ри- булозобисфосфаткарбоксил аза) отсутствуют.

Штамм является факультативным метилотрофом.

Условия хранения штамма. Шамм хранится в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда - молоко, при этом свойства штамма устойчивы. В ла0 бораторных условиях культура поддерживается на косяках с МПА и пересевается через 2 нед.

Поскольку карбоксилэстераза, осуществляющая гидролиз эфирной связи метила5 цетата, индуцибельна, существенные отличия наблюдаются при использовании этого субстрата адаптированной и не адаптированной культурой. Адаптированная культура Pseudomonas sp. BKM В-1735Д

0 осуществляет разложение метилацетата при его концентрациях 0,1 - 2,0 г/л за 9-30 ч соответственно (таблица).

В стоках ацетальдегидного производства содержится около 0,15-0,29 г/л метила5 цетата, однако при залповых выбросах концентрация этого соединения может дог стигать 1,0 г/л.

Пример 1. Использование метилацетата неадаптированной культурой.

С Культуру Pseudomonas sp. 24 RA выращивают на МПА в течение суток. Суспензию выросшей культуры (неадаптированной) высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды следующего состава, г/л дистилли5 рованной воды: (МНфНгРОз 1-0; teHPO-i 1,0; NaCI 5,0; MgS04 -7Н20 2,0; FeS04-7H20 0,004. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин, метилацетат вносят в колбу в концентрации 1 г/л и после засева закрывают резиновой

0 пробкой для предотвращения испарения метилацетата.

Культуру выращивают на качалке при 180 об./мин при 29°С. Контроль за процессом деградации метилацетата и анализ

5 содержания метанола осуществляют с помощью газовой хроматографии на хроматографе. Колонка (70 см, р 2 мм) заполнена Порапаком Q. Скорость На 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, № 30 мл/мин. Температу0 ра колонки 110°С.

Ацетат определяют на газовом хроматографе. Колонка (1,8 M,J# 4 мм) заполнена Порапаком Q. Скорость Н2 35 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, N2 35 мл/мин. Температу5 ра колонки 160°С,

Процесс разложения метилацетата неадаптированной культурой начинается только через 7 сут. Содержание метилацетата по данным газовой хроматографии через 5 сут составляет 97% от исходного, через 6 сут

92%, через 7 сут 61%, через 8 сут 10% и через 9 сут к началу стационарной фазы роста 0%. В среде накапливается 0,1 г/л метанола. Ацетат не обнаруживается.

Пример 2. Использование метилаце- тата адаптированной культурой.

30 мл суспензии, выросшей на среде с метилацетатом двухсуточной культуры Pseudomonas sp. 24 RA ВКМ В-1735 Д (адаптированной не менее 3 пассажей на среде с метилацетатом), высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды, описанной в примере 1. В качестве источника углерода и энерги.и вносят 1 г/л метилацетата. Количественный газохроматографический анализ культуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждые 3 ч в течение 30 ч культивирования, К 15 ч культивирования

0

5

0

деградируется 25% метилацетата, к 30 ч культура достигает стационарной фазы роста и метилацетат в среде не обнаруживается. В среде накапливается 0,1 г/л метанола, ацетат отсутствует.

Таким образом, штамм Pseudomonas sp. ВКМ В-1735 Д обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 1 г/л, используя продукции его гидролиза,ацетат и метанол в качестве источников углерода и энергии, что обеспечивает возможность использования данного штамма при биологической очистке промышленных сточных вод ацетальдегид- ного производства.

Формула изобретения Штамм бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д, разлагающий метилацетат.

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства. Целью изобретения является получение нового штамма микроорганизма, обладающего способностью разлагать метилацетат. Штамм PSEUDOMONAS SP. ВКМ В-1735Д выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР. Штамм обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 1 г/л, используя продукты его гидролиза - метанол и ацетат в качестве источников углерода и энергии. После предварительной адаптации культуры она полностью разлагает метилацетат за 30 ч. 1 табл.