Штамм вируса болезни Гамборо для производства вакцин Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве вакцин против болезни Гамборо.

Цель изобретения - штамм вируса болезни Гамборо, легко культивируемый в культуре клеток куриных фибробластов с высокой биологической активностью.

Авирулентный штамм ВНИВИП вируса болезни Гамборо адаптирован, поддерживается и титруется в культуре клеток куриных фибробластов, под агаровым покрытием образует однородные бляшки размером 1,0-1,5 мм. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под № 2200.

Пример 1. Штамм активно репродуцируется в цитоплазме клеток куриных фибробластов с проявлением цитопатического действия вируса через 36-48 ч после заражения в виде дегенерации и округления клеток, появления в них мелкой зернистости без нарушения целостности монослоя. Титр вируса при этом составляет 105..о -гцЦбО/мл., Вирус имеет кубическую симметрию, без оболочки с диаметром 60-80 нм и относится к РНК-со- держащим вирусам семейства Blrnaviridae. Вирус устойчив к воздействию температуры 56°С в течение 30 мин, эфира и хлороформа. В лиофилизированном состоянии штамм вируса сохраняет свои иммунобиологические свойства при хранении в условиях холодильника в течение не менее двух лет.

Заражение вирусом культуры клеток не вызывает образования внутриядерных и ци- топлазматических включений в них.

О

о со

00

чэ го

Введение цыплятам различного возраста штамма в дозах 10 - 106 Т ЦД50/мл создает напряженный иммунитет, который обеспечивает защиту цыплят от заражения вирулентным штаммом данного возбудите- ля.

Пример 2. Дл культивирования и титрации вируса болезни Гамборо используют культуру клеток куриных фибробластов. Клеточную зоесь готовят путемтрипсинмза- ции (0,25%-ный растьор трипсина) ткани эмбриона в колбе с магнитной мешалкой. После центрифугирования взвеси при 1000 об./мин в течение 10 мин осадок клеток ресуспендируют в среде № 199 с добавлением 10% инактивированной при 56°С в течение 30 мин сыворотки крупного богатого скота. Подсчет количества .леюк производят при помощи камеры I оряева, Посевная доза 600-800 и.т клего. о 1 мл. Среда роста состоит nj равных количеств среды Пы- II гредг 1°9 - дс з ом 10% i ь л к i крупно ( э кот

Для зажжения испопьзуют клзтт Чую культуру через 24 после посева, когдэ фср- мируется сплошной монослой. Пеоед заражением среду из матрасов сливают и в каждый матрас вносят десятикратные разве дет-1 г вирус с объеме О Ъ мл. На разведение Bi .nycd иопьльоуют по 4 Mdif.a- са. После 30 мин инкубации при 37°С вирус сливают, монослой отмывают средой № 199 и наносят агаровое покрытие, в состав которого включали 1,5% агара Дифко, раствора Эрлз (10-кратнь й концежрат), 2.5% объем СЫВОРОТКИ, 0,и02%-нмй pjcisop нейтрального красного и 0,4 %-пый раствор бикарбоната натрия.

Активность вируса определяют по тит- озм цитопатогетюго действия. Учет и ана- лиз бляшек проводят через 48-72 ч поело заражения Измеряют только раздельные бляшки. При изучении популяции вируса болезни Гамборо в коммерческой вакцине ме- 10дом бляшек установлено, что вирус

образует бляшки разных размеров(от 0,5 до 3-4 мм).

Для получения клона вируса извлекают столбик агара под бляшкой, растворяют в 1 мл питательной среды (равный объем среды Игла и среды № 199 с добавлением 10% толя 1ьей сыворотки), вносят в пробирки с монослоем клегок куриных фибробластов, HHi ,бируют пои 37°С п течение 2-3 сут.

Н.гичие сируса регистрируют по цито- пато емкому эффекту, характеризующемуся появлением небольших, округлых, темных клеток с выраженной зернистостью и с неровными краями. Такие клетки сначала образовываются в отдельных местах монослоя, а затем число их постепенно увеличивается и через 36-48 ч охватывает до 60-80% мопо.ч.нч

Для испытания стабильности признака размера бляшек у выделенного клона размером 1,0-1,5 мм проводят 5 пассажей в культуре кло г. уриных фиброобластов. KJIGH считают стабильным, если в потомстве пассируемого вируса образовываются только бляшки размером 1,0-1,5 мм.

Устойчивость выделенного штамма к воздействию температуры, эфира и хлороформа определяют путем титрации вируса до и после воздействия н него указанных факюров.

Пример 3. При проверке на остаточную вирулентность штамма в опытах на птице разных возврастных групп устанавливают его безвредность. Введение его в пр,знизм ггип образование вируснеитг алг,зующих и вируспреципи- тирующи/ антител, что обеспечивает форм/) жие невосприимчивости вакци- нирос нь-эй птицы к контрольному заражению вирулентным штаммом вируса болезни ГапРюро.

Формула изобретения

Штамм вируса болезни Гамборо ГКВ 22oO для производства вакцин.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано при производстве вакцин против болезни Гамборо. Целью изобретения является штамм "ВНИВИП" вируса болезни Гамборо, легко культивируемый в культуре клеток куриных фибробластов с высокой биологической активностью. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под N 2200. Штамм культивируется в культуре клеток куриных фибробластов, что позволяет накопить вирусную массу в больших объемах. Титр вируса 10^5,5 - 10^6,° ТЦД₅₀/мл. Введение цыплятам различного возраста вируса в дозах 10⁵ - 10⁶ ТЦД₅₀/мл создает напряженный иммунитет, который обеспечивает защиту цыплят от заражения вирулентным штаммом данного возбудителя. Штамм безвреден для цыплят.