Способ получения производных гепарина, обладающих атромбогенным действием Советский патент 1991 года по МПК C08B37/10 A61K31/727 

Изобретение относится к способу получения новых производных гепарина, обладающих атромбогенным действием, которые можно использовать в медицине для получения атромбогенных поверхностей.

Цель изобретения - упрощение способа и возможность иммобилизации гепарина на протезах в организме без извлечения протеза при использовании целевого продукта.

П р и м е р 1. Получение N-оксисукцини- мидного эфира гепарина (ОЭГ-1), содержащего 1 активированную группу на 1 молекулу гепарина.

Получение гидрофобизованного гепарина. 500 мг гепарина (средняя мол масса 15000 дальтон) растворяют в 30 мл 0,1 М тетрабората натрия, рН 9,2, добавляют 1 г янтарного ангидрида при перемешивании Уменьшение рН компенсируют внесением 10 М NaOH под контролем рН-метра. Оставляют стоять 1 ч, диализуют 3 раза против 3 л диет, воды в течение 12 ч, 3 раза против 1 л 20 мМ триэтиламина в течение суток, лио- филйзуют, хранят на -20°С. Выход 500 мг гидрофобизованного гепарина

Этерификация. 45 мг гидрофобизован- ного гепарина вносят в 1,2 мл ДМФА, добавляют 20 мг N-оксисукцинимида и 26 мг

сь о ч чэ

о

дициклогексилкарбодиимида и оставляют стоять на сутки при 20°С Раствор охлаждают до -20°С, фильтруют. К фильтрату добсв- ляют 15 мл эчилацетата, высушивают на воздухе, хранят при -20°С. Выход 50 мг(80% от теоретического). Продукт содержит 1 моль сукцинимидных групп на 1 моль гепарина (см. пример 4), хорошо растворим в диметилформамиде (ДМФА), диметилсуль- фоксиде (ДМСО) и воде, не растворим в неполярных органических растворителях. После полного шдролиза в воде (1 ч, 20°С 0,15 М хлористого натрия, рН 7,4) образуется раствор гепарина, имеющий 80% аптико- агуляционной активности исходного гепарина.

Прим е р 2. Получение ОЭГ- Л содержащего 5 актииирочанных ipvnn на I молекулу гепарина.

Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что на 45 мг t ид- рофобизовапного гепарина Ьерут 100 мг N-оксисукцинимида и 130 м; дициклогск- силкарбодиимида. 78 мг (03% от теоретического). Свойсюп продукта таки же как в примере 1. за исключением того, что на 1 моль гепарина приходится 5 моль сук- цинимидных групп.

П р и м е р 3. Получение ОЭГ-10, содержащего 10 активированных групп на 1 миле- кулу гепарина

Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что на 4J мг гид рофобизованного гепарина берут 200 мг N-оссисукцинимида и 260 мг дициклогьк- силкарбодиимида. Выход 100 MI ( от теоретического). Свойсгса продукта такие же как в примере 1, за исключением того, что на 1 моль гепарина приходи гея 10 моль сукцинимидных групп.

П р и м е р 4. Определение коли--,ества N-оксисукцинимидных групп в ОЭГ-1, ОЭ1- 5 и ОЭГ-10.

В кювету спектрофотометра вносят 3 мл 0,1 М тетрабората натрия, рН 9,2, и 10 мкл раствора (30 мг/мл) ОЭГ-1 или ОЭГ-5, или ОЭГ-10 в ДМФА и фиксируют изменение оптической плотное)и при длине волны 260 нм. Коэффициент экстинкции выделяющегося N-оксисукцинимида равен 8400 1/моль. Для ОЭГ-1 прирост оптической плотности равен 0,12 для ОЭГ-5 0,64, для ОЭГ-10 1,23 ед. оптической плотности. Это соответствует 1,5 t, 10 моль N-оксисукцинимидных групп на 1 моль гепарина (средняя молекулярная масса около 15000 дальтон).

П р и м е р 5. Определение атромбоген- ных свойств ОЭГ-1, ОЭГ-5 и ОЭГ-10.

5.1.Подготовка тромбогенной поверхности.

В лунки полистироловой плашки (Муль- тивел, диаметр лунок 16 мм, объем лунок 2

мл) заливают по 0,5 мл раствора коллагена человека типа 1 (10 мкг/мл 0,15 М хлористого натрия) и инкубируют ночь при 20°С. Лунки отмывают физиологическим раствором (ФР) (0,15 М хлористого натрия, рН 7,5) и

вносят в них по 200 мкл ФР.

5.2.Обработка поверхности эфирами гепарина (ОЭГ).

В лунки, подготовленные по 5.1, вносят по 10 мкл растворов ОЭГ-1 или ОЭГ-5, или

ОЭГ-10, 30 мг/мл ДМСО, инкубируют 10 мин при 37°С. промывают 10 раз по 2 мл ФР. В качестве контрольной поверхности используют аналогичные белковые поверхности, обработанные раствором обычного, немодифицированного гепарина (1 мг/мл в течение 10 мин при 37°С и затем также отмытые ФР. Для сравнения свойств предлагаемых веществ с известным способом используют коллагеновую поверхность, на которой гепарии иммобилизован в соответствии с известным методом, по трехступенчатой методике.

Зависимость эффективности иммобилизации N-оксисукцинимидных эфиров

гепарина на поверхности, покрытой сывороточным альбумином человека, от параметров способа представлена ниже:

53Измерение задержки тромбинового времени.

В лунки, обработанные ОЭГ, и контрольные вносят по 0,2 мл цитратной плазмы человека и по 0,1 ед, тромбина в растворе бычьего сывороточного альбумина 1 мг/мл ФР, инкубируют при 37°С и измеряют время образования сгустка. Для контрольных лунок оно составляет 3,0+0,5 мин (), а для лунок, обработанных любым из трех ОЭГ. 8,0+2,0 мин (). Таким образом, обработка тромбогенной поверхности ОЭГ замедляет время образования сгустка в 2-3 раза по сравнению с контрольной поверхностью. Для известного способа эта характеристика не приведена.

5.4. Измерение адгезии тромбоцитов.

Тромбоциты человека получают центрифугированием1 из донорской крови,взятой в кислый цитратный антикоагулянт. Клетки инкубируютс 51-Сг-хроматом натрия 30 мин при 37°С и отделяют от несвязавшейся радиоактивной метки гельфильтрацией через Sepharose 4B (Farmacia, Швеция). В результате, 0,2 мл суспензии тромбоцитов (100 млн/мл) имеют радиоактивность 60000 имп/мин.

В контрольные, обработанные ОЭГ и гепарином по известному методу лунки (см.5.2) вносят по 1 мл цитратной плазмы и инкубируют 60 мин при 37°С, затем плазму сливают и в лунки вносят по 200 мкл цитратной плазмы и по 200 мкл описанной выше суспензии тромбоцитов. Лунки инкубируют, плавно покачивая 1 ч при 37°С, отмывают 4 раза по 1 мл ФР и просчитывают связавшуюся с ними радиоактивность. По связавшейся радиоактивности определяют количество

адгезированных на поверхности тромбоцитов. В контрольных лунках связывается 8,0+1,0% внесенных тромбоцитов, в лунках, обработанных ОЭГ-1 2,3+1.5%. ОЭГ-5

2,4-4,3%, ОЭГ-10 2,6+1.2% (n-З). В лунках, обработанных в соответствии с известным методом 3,1+1,1 % ().

Видно, что адгезия тромбоцитов после обработки тромбогенной поверхности ОЭГ

уменьшается в 2-4 раза по сравнению с контрольной поверхностью и достоверно не отличается от адгезии на поверхности, полученной в соответствии с соединением известного способа.

Обработка тромбогенной поверхности

полученными эфирами гепарина вызывает задержку тромбинового времени и снижение адгезии тромбоциюв

Предлагаемые М-оксисукцинимидные

эфиры гепарина - аморфные вещества, растворимые в воде, ДМФА, ДМСО. гигроскопичны. Они обладают оригинальными свойствами: способны быстро реагировать

с аминогруппами тромбогенной поверхности, а в случае гидролиза образуется исход- ный гепарин, имеющий практически неизмененную актикоагулянтную активность. Как при гидролизе, так и в случае

присоединения эфиров гепарина к поверхности не выделяется никаких токсичных продуктов Последнее обстоятельство важно, так как позволяет использовать предлагаемые продукты для элементов аппаратов. имеющих непосредственный контакт с кровью, не извлекая их из организма больного. При этом часть эфиров гепарина присоединяется и обеспечивает кратковременное антикоагулянтное действие

В известном способе химическая иммобилизация гепарина сложна, многостадийна, требует больших количеств дорогостоящего водорастворимого карбодиимида. Иммобилизацию гепарина нельзя проводить

не извлекая протез из организма больного

Производные гепарина пригодны и для обработки поверхностей in vitro. В отличие от ранее известных предлагаемые вещества позволяют существенно удешевить, упростить и ускорить процесс иммобилизации гепарина, так как вместо трех длительных и трудоемких стадий с использованием дорогих и ядовитых веществ иммобилизацию

можно провести в одну стадию в физиологических условиях. При этом не используется и не выделяется токсических веществ отпадает необходимость отделят продукты побочных реакций.

Формула изобретения

7 16699198

Способ получения производных геле-пенный сухой продукт растворяют в безводрина. обладающих атромбогенным действ -ном диметилформамиде и полученный расем, отличающийся тем, что, с цельютвор обрабатывают N-оксисукцинимидом и

упрощения способа и возможности иммо-днциклогексилкарбодиимидом в молярном

билизации гепарина на протезах в орга-5 соотношении 1:1, причем количество каждонизме без извлечения протеза приго компонента составляет 1-10 моль на 1

использовании целевого продукта, гепа-моль гепарина, реакционную смесь инкубирин обрабатывают 20-100-кратным моляр-руют при комнатной температуре, выделяным избытком янтарного ангидрида в 0,1ют дициклогежсилмочевину при охлаждении

М водном растворе тетрабората натрия,10 раствора, а целевой продукт осаждают этидиализуют против дистиллированной во-лацетатом из фильтрата, ды с последующей лиофилизацией, выде

Изобретение относится к способам получения новых производных гепарина, обладающих атромбогенным действием, которые могут быть использованы в медицине для получения атромбогенных поверхностей. Изобретение позволяет упростить способ и получить возможность иммобилизации гепарина на протезах в организме без извлечения протеза при использовании полученных соединений. Это достигается за счет того, что гепарин обрабатывают 20 - 100-кратным молярным избытком янтарного ангидрида в 0,1 М водном растворе тетрабората натрия, диализуют против дистиллированной воды с последующей лиофилизацией. Выделенный сухой продукт растворяют в безводном диметилформамиде и полученный раствор обрабатывают N-оксисукцинимидом и дициклогексилкарбодиимидом в молярном соотношении 1:1, причем количество каждого компонента составляет 1 - 10 молей на 1 моль гепарина, реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре, выделяют дициклогексилмочевину при охлаждении раствора, а целевой продукт осаждают этилацетатом из фильтрата. 1 табл.