Способ оценки осмотической резистентности лейкоцитов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии и гематологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов.

Цельизс 6реппения-гк)вышениеточностм способа

Способ осуществляют следующим образом.

Выделяют на двойном градиенте плотности чистую популяцию лейкоцитов: берут плазму, обогащенную лейкоцитами в концентрации 106 клеток в 1 мл, из отстоявшейся в течение 45-60 мин при 37°С венозной гепаринизированной крови, смешанной с половиной объема 6.% (вес - объем) декстра- на 75, супернатант наслаивают на двойной градиент фиколлверографина (1,093-1,078) и центрифугируют в течение 30 мин при 4°С, 1500 об/мин. Затем нижний слой клеток,

состоящий на 75-80% из нейтрофилов, собирают и дважды отмывают в среде 199 (1500 об/мин, 4 °С, 3 мин), ресуспендируют в конечной концентрации (1 х 107) кл/мл, клетки со средой 199 в количестве 32 мкл помещают в 10 мл физиологического раствора и 10 мл 0,4-0,5%-ного раствора натрия хлорида.

Оценку осмотической резистентности лейкоцитов проводят с помощью кондукто- метрии, на гемоцитометре. Измерения осуществляют на гемоцитометре через 1,15,30.45 мин в опыте (в гипотоническом растворе) и i сразу - в контроле (в физиологическом растворе), регистрируют количество осмотически устойчивых клеток (%). По изменениям осмотической резистентности исследуемого образца относительно контроля и в сравО х|

сл

v|

Os 00

нении с показателями осмотической рези- стентностм у доноров (норма) судят о сниже- нии осмотической ррзисг нтности или повышении ее.

Учет осуществляют с помощью гемоци- тометра Лаборскель-Анаяизат р (фирма Медикор).

Условия измерения: диаметр капилляре 100 мкм, ток. применяемый для измерений 100 мкА, пороги дискриминации для физиологического раствора 2,5-7,5 В, для гипотонического 4,3-5,1 В (для доноров). Выбор напряжения дискриминации для подсчета осмотически устойчивых клеток зависит от результатов предварительной регистрации по монитору импульсов, составляющих более 60% от длины ординаты.

Кроме определения собственно осмотической резиетентности, предлагаемый способ позволяет регистрировать кривую распределения клеток в зависимости от диаметра, максимальный диаметр и объем, до которого увеличиваются клетки перед разрушением (а также количество соответствующих клеток): по монитору на оси абсцисс регистрируют номер канала, в пике кривой распределения, относящегося к наибольшему количеству клеток данного диаметра, в гипотоническом растворе максимальный диаметр, до которого увеличиваются клетки, регистрируют через 1 ммн после помещения клеток в гипотонический раствор. измерения - режим дифференциальной дискриминации. Регистрация максимального диаметра, до которого увеличиваются клетки перед разрушением, дает возможность оценить степень эластичности мембраны клеток, которая, наряду с осмотической резистен- тностью, имеет большое значение в диагностике мембранных нарушений.

Расчет диаметра клеток производят по формуле .

, D 0,666825 / ( KuGl )1/3 .

где К - коэффициент измерительной трубки (8,619 Ю 3);

Сп - номер канала;

U - величина измеряемого тока (1-10 А).

Расчет объема клеток проводят по формуле:

Сп

V 0,15625

U -а

-для

где а - коэффициент формы частиц 11 гранулоцитов примерно равен 1,5.

Определяли коэффициент набухания клеток по формуле:

,

где А - средний диаметр клеток в изотоническом растворе;

8 - средний диаметр клеток в гипотоническом растворе.

Значение коэффициента набухания меньше 84,553% свидетельствуют о повышении эластичности мембраны, значение этого показателя, превышающее 89,247%, свидетельствуют о снижении ее.

Средний диаметр клеток в физиологическом растворе (контроль) составляет 12,Б±0,599 мкм; средний объем 1022,1351 ±146.0206 мкм5.

Средний диаметр, до которого клетки набухают в гипотоническом растаоре 14,384±0,3 мкм; средний объем 1557,5392± 97,3462 мкм3.

П р и м е р 1. Донор А. Проводили исследование осмотической резистентности лейкоцитов (гранулоцитов) в соответствии с предлагаемым способом. Брали плазму, обогащенную лейкоцитами в концентрации 10 кл/мл из отстоявшейся в течении 45 мин при температуре 37°С венозной гепарини- зированкг.Л крови, смешанной с половиной объема 6% (вес/обьеги) декстрана 75, супернатант наслаивали на двойной градиент фиколлверографина (1,093-1,078) и центрифугировали в течение 30 мин при 4°С и 1500 об/мин. Нижний слой клеток, содержащий гранулоциты,собирали и дважды отмывали в среде 199 (1500 об/мин, 4°С, 3 мин), ресуспендировали в конечной концентрации 10 клеток в мл. Клетки со средой 199 в количестве 32 мкл помещали в 10 мл

физиологического раствора и в 10 мл 0,45 %-ного раствора натрия хпорида. Измерение проводили на гемоцитометре Лаборскель- Анализатор сразу, через 1, 15, 30, 45 мин. Диаметр капилляра 100 мкм при силе тока 100 мкА. Порог дискриминации для физиологического раствора 2,5-7,5 В, для гипотонического 4,3-5,1 В. Получили соответственно через 15, 30, 45 мин значения осмотической резистентности лейкоцитов (гранулоцитов): 78,21%; 58,74%; 45,13%.

Полученные показатели свидетельствуют о нормальной осмотической резистентности лейкоцитов донора А.

Одновременно с регистрацией количества клеток регистрировали номер канала (в 5 пике кривой распределения), относящийся к наибольшему количеству клеток данного диаметра. По формулам

К Сп ,1/з U

0

5

0

5

0

5

0

5

0

D-0,866825 /(

)1

V-0,15625

к сп

U -а

производили расчет среднего диаметра клеток и объема в физиологическом и гипотоническом растворах. По формуле

п |100%

определили коэффициент н&буханчя.

Средний диаметр клеток, до которого они увеличивались в гипотоническом рас- творэ составил 14,5395 мкм, средний объем 1606,2123 мкм3; в физиологическом растворе средний диаметр 12,6955. объем г. 1022,1351 мкм3„ Коэффициент набухания 86,014%.

Полученные данные свидетельствуют о нормальных размерах и эластичности мембраны лейкоцитов у данного донора.

П р и м е р 2. Проводили определение одного и того же образца крови донора с различными исследованиями в соответствии с предлагаемым и известным способа- ми.

Из представленных результатов видно, что колебания данных в предлагаемом спо- собе намного меньше, чем в известном, что также свидетельствует о высокой точности и объективности предлагаемого способа.

Проведенные испытания предлагаемого способа подтвердили его преимущества перед известными способами оценки осмотической резистентное™ лейкоцитов, заключающиеся в повышение объективности результатов, точности - за счет замены ви- зуэльно микроско, оческой оценки нч обь- ективную гемоцитометрию. Кроме оценки осмотичесой резистентное™ лейкоцитов, способ позволяет определять и степень набухания уцелевших клеток, регистрировать максимальный диаметр клеток, до которого они набухают перед разрушением, т.е. позволяют получить более полную информацию о функциональной активности лейкоцитов. Замена трудоемкой, утомительной визуальной микроскопии не только повышает объективность и, следовательно, точность получаемых результатов, но значительно улучшает условия работы исследователя. Формула изобретения Способ оценки осмотической рези- стенткости лейкоцитов путем инкубации с раствором хлорида натрия клеток периферической крови с последующим учетом реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, из периферической крови выделяют чистую популяцию лейкоцитов нз двойном градиенте плотности и инкубируют с 0,4-0,5%-ным раствором нгчрия хлорида, а учет реакции ведут по количеству неразрушенных клеток с помощью гемоцитометра.

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии и гематологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов. Целью является повышение точности оценки осмотической резистентности лейкоцитов. Для этого выделяют на двойном градиенте плотности фи- коллаверографина чистую популяцию лейкоцитов, которую инкубируют с гипотоническим 0,4-0,5%-ным раствором хлорида натрия, затем с помощью гемоцитометра регистрируют количество уцелевших клеток (через 14, 30,45 мин, например). По изменению полученных показателей в сравнении с аналогичными показателями у доноров (норма) судят о снижении или повышении осмотической резистентное™ лейкоцитов. Предлагаемый способ позволяет повысить объективность результатов за счет замены визуальной микроскопической оценки на объективную оценку с помощью гемоцитометра.