Питательная среда для культивирования пыльников риса Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию In vitro зерновых культур, преимущественно риса, и может быть использовано в растениеводстве, физиологии растений.

Цель изобретения - повышение интенсивности образования каллуса из пыльников.

В питательную среду, включающую азотнокислый кальций, азотнокислый калий, сернокислый магний, азотнокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый калий, сернокислый цинк, борную кислоту, сернокислый марганец, йодистый калий, этилендиамин-тетрацитат натрия (ЭДТА), сернокислое железо, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, глицин, сахарозу, агар-агар и 2,4- дихлорфеноксиуксус- ную кислоту, дополнительно вводят крезацин (трис-(2-оксиэтил)аммоний-2-ме- тилфеноксиацетат) в качестве дедифферен- циатора при соотношении компонентов, мас.%, указанном в табл.1.

Крезацин - биологически активное вещество, по химической природе являющееся трис-(2-оксиэтил)аммоний-2-метилфеноксиа- цетат. Относится к классу трис-(2-оксиэ- тил)аммониевых солей ароксиуксусных кислот. По механизму действия имитирует природные ауксины, обладая, однако, гораздо более высокой активностью. Крезацин применяется в животноводстве для регулирования метаболических процессов в организме животных.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Для экспериментальной проверки питательной среды готовят шесть сред. Опыты с культивированием пыльников риса сорта Старт и гибрида FI ВНИИриса 1588хМ-301 на средах проводят в трехкратной повтор- ности.

П р и м е р 1. Пыльники риса культивируют на среде, известной ранее, которую готовят по следующей технологии.

О

VI

00

м

ел а

В 800 мл дистиллированной воды добавляют 8000 мг агар-агара и путем кипячения готовят агаровый гель. Затем в него добавляют ингредиенты, мас.%: Са(МОз)2Х х4Н20 0,8500; КМОз 2,4403; MgSCM THaO 0.0736; МЩМОз 2,4496; КН2Р04 0,7323; KCI 0,1676; ZnS04 7H20 0,0097; НзВОз 0,0051; MnS04 4H20 0,0110; KJ 0,0119; МаЭДТА 0,0981; FeS04 7H20 0,0689; тиамин HCI 0,0002; пиридоксин HCI 0,0005; никотиновая кислота 0,0016; глицин 0,0049; агар-агар 19,5867; сахароза 73,4978; вещество-дедиф- ференциатор - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 0,0002. Общий объем приготовляемой среды доводят до 1000 мл добавлением дистиллированной воды. Затем среду тщательно перемешивают. Растворами HCI и NaOH устанавливаютрН среды 5,8.

Горячую питательную среду разливают в 16 мм пробирки, которые закрывают ват- но-марлевыми пробками и автоклавируют при 1 атм 25 мин. Пыльники риса высаживают на застывшую агаризованную поверхность в стерильных условиях. Пробирки с пыльниками помещают в термостат при 28°С, через 25-30 дней подсчитывают количество пыльников, давших каллус (табл .2).

П р и м е р 2. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде, мас.%, следующее: Са(МОз)24Н20 0,9935; КМОз 3,1001; MgS04X х7Н20 0,0701; 2,0974; КН2Р04 0,7102; KCI 0,1438; ZnSCM 7H20 0,0089; НзВОз 0,0023; MnS04 4H20 0,0197; KJ 0,0061; №ЭДТА 0,2064; FeSCM 7H20 0,0811; тиамин HCI 0,0008; пиридоксин HCI 0,0008; никотиновая кислота 0,0019; глицин 0,0060; сахароза 75,1344; агар-агар 17,4162; 2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота 0,0002; крезацин 0,0001; сухого вещества в растворе 6,0 мас.%, остальное - вода.

П р и м е р 3. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде, мас.%, следующее; Са(МОз)2 4 Н20 0.9741; КМОз 3,0287; MgS04X х7Н20 0,0829; МН4МОз 2,1434; КН2Р04 0,7226; КС 0,1698; ZnS04 7H20 0,0036; НзВОз 0,0047; MnS04 4H20 0,0120; KJ 0,0013; МаЭДТА 0,0920; FeS04 7H20 0,0651 ; тиамин НС 0,00005; пиридоксин HCI 0,0005; никотиновая кислота 0,0018; глицин 0,0039; сахароза 74,1995; агар-агар 18,4938; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,00005; крезацин 0,0002; сухого вещества в растворе 6,1 мас.%, остальное - вода.

П р и м е р 4. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов .

предлагаемой среде, мас.%, следующее: Са(МОз)2 4Н20 0,8499; КМОз 2.4594; MgS04 7Н20 0,0857;-NH4N03 2,4493; КН2Р04 0,7348; КС 0,1592; ZnS04 7H20 0,0039;

НзВОз 0,0039; MnS04 4H20 0,0108; KJ 0,0019; МаЭДТА 0,0936; FeS047H20 0.0681; тиамин НС 0,0002; пиридоксин HCI 0,0002; никотиновая кислота 0,0012; глицин 0,0049; сахароза 73,4797; агар-агар 19,5928; 2,4дихлорфеноксиуксусная кислота 0,0001; крезацин 0,0004; сухого вещества в растворе 6,15 мас.%, остальное - вода.

П р и м е р 5. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде, мас.%, следующее: Са(МОз)2 0,7659; КМОз 2.1047; MgS04 7H20 0,1001; Н4МОз 2,6594; КН2Р04 0,8324; KCI 0,1490; ZnS04 7Н20 0,0049; НзВОз 0,0028;

MnS04 4H20 0,0101; KJ 0,0022; МаЭДТА 0,1110; FeS04 7H20 0,0606; тиамин HCI 0,0006; пиридоксин НС 0,0003; никотиновая кислота 0,0010; глицин 0,0057; сахароза 72,9353; агар-агар 20,2431; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,0002; крезацин 0,0006; сухого вещества в растворе 6,4 мас.%, остальное - вода.

П р и м е р 6. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде, мас.%, следующее: Са(МОз)2 0,7591; KN03 2,0984; MgS04 7H20 0,1011; NH4N03 2,6708; КН2Р04 0,8397; КС 0,2799; ZnS04 7Н20 0,0034; НзВОз 0,0051;

MnS04 4H20 0,0099; KJ 0,0010; МаЭДТА 0,0902; FeS04 7H20 0,0642; тиамин HCI 0,0001, пиридоксин HCI 0,0001, никотиновая кислота 0,0008; глицин 0,0037; сахароза 71,3474; агар-агар 21,7241; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,0002; крезацин 0,0008; сухого вещества в растворе 6,6 мас.%, остальное - вода.

Результаты экспериментов представлены в табл. 2, где а - минимальное количество компонента в питательной среде, б - оптимальное, в - максимальное (согласно табл.1)

Как следует из экспериментальных дан- ных, использование оптимального варианта питательной смеси обеспечивает увеличение каллусогенеза относительно известного способа на 67,5%. Последнее очень важно, так как количество пыльников отдельных гибридов и других форм, получаемых в едит ничных экземплярах, недостаточно. Кроме того, повышение частоты каллусогенеза позволяет уменьшить объем приготовления среды, количество повторностей, лабораторной техники и рабочего времени.

Формула изобретения Питательная среда для культивирования пыльников риса, включающая азотнокислый кальций, азотнокислый калий, сернокислый магний, азотнокислый аммоний, фосфорнокислый однозамещенный калий, хлористый калий..сернокислый цинк, борную кислоту, сернокислый марганец, йодистый калий, этилендиамин-тетрацитат натрия, сернокислое железо, тиамин, пири- доксин, никотиновую кислоту, глицин, сахарозу, агар-агар и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения интенсивности образования каллуса из пыльников, она дополнительно содержит крезацин при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Азотнокислый кальций 0,7659-0,9741 Азотнокислый калий 2,1047-3,0287 Сернокислый магний 0,0829-0,1001 Азотнокислый аммоний 2,1434-2,6594

Фосфорнокислый однозамещенный калий Хлористый калий Сернокислый цинк Борная кислота Сернокислый марганец Йодистый калий

Этилендиамин-тетрацитат натрия

0 Сернокислое железо Тиамин

Ниридоксин

Никотиновая кислота 5Глицин

Сахароза

Агар-агар

2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота 0 Крезацик

0,7226-0,8324 0.1490-0,1698 0,0036-0.0049 0.0028-0,0047 0,0101-0,0120 0,0013-0,0022

0,0920-0.1110

0,0651-0,0707 0,00005-0,0006

0,0003-0,0005 0.0010-0,0018 0,0039-0.0057 72,9353-74,1995 18,4938-20.2431

0,00005-0,0002 0,002-0,0006

Дистиллированная вода Остальное

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию in vitro зерновых культур, преимущественно риса, и может быть использовано в растениеводстве, физиологии растений. Целью изобретения является повышение интенсивности образования каллуса из пыльников. Питательная среда, согласно изобретению, включает в себя набор макро- и микроэлементов, при этом в качестве дедифференци- атора в ней дополнительно содержится крезацин. 2 табл.

Таблица 1

Известная270

Предлагаемая

б) (содержание крезацина 0,0001 мас.%)

а

б

в

б (содержание крезацина 0,0008 мас.%) 270

Таблица2

570

19

570

27