Способ трансформации возбудителя чумы Советский патент 1990 года по МПК C12N15/63 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для моделирования вирулентности чумного микроба с целью исследования роли плазмидных и хромосомных факторов в развитии инфекционного процесса при чуме и, следовательно, для выяснения генетических основ патоген- ности и иммуногенности возбудителя чумы.

Цель изобретения - упрощение способа.

В качестве генетического маркера, по выражению которого ведется отбор трансформантов,получивших плазмиду

pCad,используют вирулентность возбудителя чумы. Плазмида pCad не обладает удобным селектируемым маркером, но детерминирует синтез ряда факторов вирулентности (признак кальцийза- висимости, синтез v-антигена и термо- индуцибельных белков внешней мембраны) , которые в сочетании с хромосомными признаками Pgm и Pst придают клеткам способность вызывать летальный инфекционный процесс. Поэтому совмещение этих признаков в одной клетке придает ей вирулентные свойства и, следовательно, позволяет отбирать трансформанты, получивнше pCad, в организме чувствительного биопробО

о «

с

QD СлЭ

ного лсивот)лого, т.е. в условиях in

vivo. I

П р н м е р. ДНК нативной плазмиды pCad (47 Md) вьщеляют из моноплазмид- ного штамма ультрапентрифугнрованием в градиенте плотности хлористого цезия. Авирулемтный бесплазмидный штамм возбудителя чумы, иесупщй хромосомные маркеры Pgm и Pst, вьфащивают на агаре Хоттингера (рН /,2) в течение 18-24 ч при 28°С. Клетки дважды отмывают холодной дистиллированной водой и ресуспендируют в 0, пеп- тонной воде. Взвесь клеток смешивают с препаратом ДНК так,; что 1 мкг плазмидной ДНК приходится на 110 клеток реципиента, и подвергают процедуре криотраисформации путем замораживания при -195 С в течение 5 мин и оттаивания при в течение 2 - 10 мин. Смесь разбавляют равным объемом бульона Хоттиигера или LB (рН 7,2) и инкубируют в течение 1 ч при . Затем трансформационную смесь в объеме 0,2-0,5 мп вводят подкожно или внутрибрюшинно белым мышам или

морским свинкам. После гибели биопроб ного животного, которая обычно наступает на 3-5 сут после заражения, производят вскрытие и прямой посев органов методом отпечатков на агар Хоттингера (рН 7.2), содержащий генцианвио- лет в конечном разведении 1:200000 . в качестве ингибитора посторонней 1- Икрофлоры,

;

Культура возбудителя чумы, выделенная из органов павшей биопробы, в 100% случаев представляет собой культуру трансформантов, получивших плазмиду pCad;

0

Таким образом, преимуществом-предлагаемого способа трансформации возбудителя чумы плазмидиоу рСасЗ является повышение эффективности получения трансформантов, Hecymjjx плазмиду pCad, с 1,2-3,0 до 100%. Кроме того, предлагаемый способ проще известного за счет исключения ряда этапов, связанных с вьцделением и использованием ДНК вспомогательной плазмиды, приготовлением селективных искусственных питательных сред, содержащих антибиотики, повторным отбором трансформантов, определением у них наследования неселектируемых фенотипических признаков плазмиды pCad и :излечиванием от вспомогательной плазмиды. Следовательно, предлагаемый способ позволяет экономить питательные среды, хим- реактивы и антибиотики. Кроме того, снижается биологическая опасность для окружающей среды трансформантов возбудителя чумы, не обладающих устойчивостью к антибиотикам. Формула изобретения

Способ трансформации возбудителя чумы, включающий выделение плазмилтной ДНК кальцийзависимости, введение плазмидной ДНК в клетки peцliпиeнтнoгo штамма в условиях замораживания-от-- таивания, культивирование и отбор трансформантов, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве реципиентного штамма используют авирулентный штамм Yer- sinia pestis, несущий признак пигмент- сорбции Р§п1 и чувствительность к пес- 0 тицину Pst, в качестве плазмидной ДНК - плазмиду pCad, культивирование осуществляют в организме биопробного животного, а отбор трансформантов проводят по признаку вирулентности.. .

0

5

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что содержащими плазмиду PCAD трансформантами штамма, несущего хромосомальные признаки PGM + и PST^S (пигментсорбция и чувствительность к пестициду соответственно), заражают биопробное животное с последующим отбором клонов по признаку вирулентности.