Способ определения кортикостероидов в плазме крови Советский патент 1991 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к биохимии, может быть использовано в физиологии и позволяет определять содержание кортикостероидов в крови, свидетельствующее об активности гипофизарно-адренокортикаль- ной системы.

Цель изобретения - сокращение объема плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирки объемом 4,мл помещают 0,1 мл исследуемой жидкости (стандарт, контроль, плазма крови) и добавляют 1,5 мл хлористого метилена Пробирки встряхивают на лабораторной качалке в течение 3 мин и замораживают в течение 20 мин при -20°С в холодильнике или в течение 1-2 мин с помощью охлаждающей смеси этиловый спирт - углекислота, при этом холестерин и другие липиды вымораживаются с водой. Метиленхлоридный экстракт сливают с замороженного слоя в чистые пробирки и в каждую пробирку добавляют с помощью микробюретки 0,5 мл флюоресцентного реактива (смесь серная кислота.абсолютный этиловый спирт в соотношении 7:3 приготавливается медленным приливанием кислоты в спирт при охлаждении). Пробирки встряхивают на лабораторной качалке течение 3 мин Верхний слой хлористого метилена отсасывают с помощью пастеровской пипетки, соединенной с водоструйным насосом. Через 1,5 ч измеряют флюоресценцию По флюоресценции стандартов и контроля строят калибровочную кривую и находят содержание кортикостероидов в испытуемых образцах В общей сложности определение 50 проб занимает 3-4 ч.

Способ поясняется следующим примером

Пример. Определение кортикостеро- ида в плазме крови крысы в хроническом опыте.

v

Ё

О N) CJ Ю

Из хвостовой вены крысы набирают 0,26 мл крови и переносят з центрифужную пробирку. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин, Отбирают 0,1 мл плазмы в пробирку объемом 4 мл, В аналогичные пробирки наливают по 0,1 мл биди- стиллированной воды (контроль) и стандартного раствора, содержащего 0,5 мкг/мл кортикостерона (стандарт). В каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлористого |метилена, встряхивают в течение 3 мин и затем замораживают в течение 20 мин при -20°С в холодильнике. Метиленхлоридный экстракт сливают с замороженного водного слоя и добавляют к нему 0,5 мл флюоресцентного реактива. Пробирки встряхивают в течение 3 мин, хлористый метилен отсасывают и через 1,5 ч измеряют флюоресценцию стандарта, контроля и пробы 1 при длине волны возбуждения 470 нм, флюоресценции - 530 нм. При этом флюоресценцию стандарта выставляют равной 100%. Расчет содержания кортикостерона в плазме крови проводят по следующей формуле:

Содержание кортикостерона СгСД|п-Дк)

Дет - Дк

где Ст - концентрация кортикостерона в стандартном растворе;

Дет - флюоресценция стандартного раствора;

Дк - флюоресценция контроля;

Дп - флюоресценция пробы.

0

5

0

5

0

Получены результаты: Ст 0,5 мкг/мл; Дст 100;Дк 5;Дп 64.

Содержание кортикостерона

) 0,з11мкг/м„.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет снизить объем исследуемой пробы в 10 раз (т.е. может считаться микрометодом), уменьшить минимальное определяемое количество кортикостерои- дов в 15 раз, уменьшить количество используемых реактивов (хлористого метилена - в 5,3 раза; петролейный эфир не используется; этилового спирта и серной кислоты - в 6-8 раз), снизить трудоемкость определения (уменьшает количество операций и устраняет встряхивание руками), за счет чего сокращается время определения и повышается точность тестирования в 2 раза.

Формула изобретения Способ определения кортикостероидов в плазме крови, включающий экстракцию

плазмы метиленхлоридом, обработку мети- ленхлоридного экстракта смесью серной кислоты и этилового спирта с последующей регистрацией флюоресценции, отличающийся тем, что, с целью сокращения объема плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности, пробу с добавленным хлористым метиленом встряхивают, замораживают, а метиленхлоридный экстракт сливают.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в физиологии. Цель изобретения - сокращение объема плазмы за счет повышения чувствительности способа при одновременном повышении точности Способ включает экстракцию кортикостероидов из 0,1 мл плазмы хлористым метиленом, замораживание плазмы с метиленхлоридным экстрактом и последующее сливание экстракта Затем добавляют к экстракту флюоресцентный реактив (смесь абсолютный этиловый спирт-серная кислота в отношении 3:7) и измеряют флюоресценцию Изобретение позволяет уменьшить минимально определяемое количество кортикостероидов в 15 раз