Способ определения тиопентала натрия в крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 A61K31/515 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследований, и может быть использовано для количественного определения тио- пентала натрия (Т.Н) в биологическом материале.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Сущность метода заключается в том, что к йодо-азидному реактиву добавляют пробу с ТН и измеряют падение экстинкции (ДД) через 1 мин на фотоэлектррколориметре ( А 340 нм).

#одо-азидная реакция чувствительна уже к 1 нг тиопентала. Линейная зависимость изменения (дД) от количества ТН в пробе находится в пределах 5 - 100 нг.

В табл. 1 приведена зависимость изменения оптической плотности (ДД) от количества ТН (средние величины из трех измерений).

Воспроизводимость результатов определения ТН оценивают по результатам восьми опытов (табл. 2)

В табл. 2 показана воспроизводимость результатов определения тиопен тала натрия (в пробах содер;кится по 10 нг вещества).

Специфичность способа определения ТН проверена на лекарственных препаратах, применение которых у больных совместно с ТН наиболее вероятно (табл. 3).

В табл. 3 показана специфичность метода определения ТН.

Прямое определение ТН в плазме крови невозможно, так как плазма содержит вещества, способные давать йодо-азидную реакцию (табл. 4), по- этому необходимо предварительное извлечение ТН из плазмы крови.

В табл. 4 показано изменение оптической плотности после прибавления плазмы крови, не содержащей ТН.

Способ экстракции ТН заключается в извлечении его хлороформом из кислой среды. К 0,5 мл плазмы крови, содержащей ТН, добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и встряхивают с 8 мл хлороформа в течение

- Ф

Л

со со 1

4

5 мин. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 мин отбирают 2 мл хлороформного экстракта и выпаривают на водяной бане при АО- 60°С досуха. В пробирку к сухому экстракту добавляют 2 мл воды, размешивают и отбирают 0,02 мл для определения ТН.

В табл. 5 показана характеристика способа экстракции ТН.

Таким образом, предлагаемый способ экстракции обеспечивает практически полное извлечение ТН, добавленного к плазме крови.

Для проверки специфичности способа экстракции, проводят экстракцию хлороформом из плазмы крови, не содержащей ТН (табл. 6).

В табл. 6 показано определение специфичности экстракции ТН.

Из данных таблицы видно, что хлороформный экстракт такой плазмы не содержит соединений, способных давать йодо-азидную реакцию.

Определение ТН в крови больных во время наркоза по данному методу показало, что через 15 мин после внутри- венного введения 600 мг препарата в крови обнаружено 12 мкг/мл ТН, что близко к концентрациям ТН в крови больных, определенных другими методами.

В табл. 7 приведены результаты определения концентрации ТН в крови больных.

В табл. 8 приведено сравнение флуориметрического и предлагаемого способов определения тиопентала.

I

П р им е р. Реактивы: хлороформ (очищен перегонкой), йодо-азидный . реактив,содержащий 0,6 М раствор азида натрия, 0,0025 М раствор йода и О 1 М раствор соляной кислоты (все реактивы приготовлены на бидистшши- рованной воде).

5

0

5

0

0

5

Ход определения.

К пробе плазмы крови прибавляют 0,1 М раствор соляной кислоты и хлороформ (соотношение 0,5:0,1:0,0). Пробу интенсивно встряхивают в колбе с притертой пробкой в течение 5 мин, а затем содержимое центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин. Сухой пипеткой отбирают аликвоту хлороформного экстракта и на водяной бане выпаривают досуха при 40 - 60°С. К сухому экстракту добавляют 2 мл бидистиллированной воды, встряхивают и отбирают 0,02 мл для анализа. В кювету помещают йодо-азидный реактив в составе, мл: 0,6 М раствор азида натрия 0,15 0,1 М раствор соляной кислоты 0,1; 0,0025 М раствор йода 0,15.

Измерение экстинкции йодо-азидной смеси проводят при 340 нм в кювете объемом 0,5 мл и длиной светового пути 10 мм. После этого к йодо-азидной смеси в кювете добавляют 0,02 мл пробы и через 60 с проводят повторное измерение экстинкции и рассчитывают изменение оптической плотности.

При определении тиопентала в пробах плазмы, содержащих нанограммовые количества препарата, соответственно уменьшают количество воды, прибавляемой к сухому экстракту.

Формула изобретения

Способ определения тиопентала натрия в крови путем экстракции препарата, обработки реактивом с последующим измерением оптической плотности смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, экстракт суспендируют в воде, водную суспензию обрабатывают йодо-азидной смесью при их соотношении 1:25 с последующим измерением величины оптической плотности через 1 мин при 340 нм. i Таблица 1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения тиопентала натрия в крови. Цель изобретения - повышение чувствительности способа - достигается за счет использования йодо-азидной смеси в качестве реагента на тиопентал натрия. 8 табл.

О (холостой

опыт) 0,040

5 0,122

0,082

Примечание. Проба содержит 0,15 мл 0,6 М раствора азида натрия, 0,1 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и 0,15 мл 0,0025 М раствора йода. К пробе прибавляют раствор ТН объемом 0,02 мл (в холостом опыте 0,02 мл воды) . Фртометрирование проводят в кювете с длиной светового пути, см, при Х 340 нм.

Т а б л и ц а 2 I Статистические параметры

Ci iO,0275 - среднее квадратичное отклонение отдельных результатов

X 0,156 - среднее арифметическое

S 0,00972 - средняя квадратичная ошибка

V 3,26% - коэффициент вариации

Продолжение табл. 1

Таблица 3

17199748

Продолжение табл.3 ,

Примечание. Количество препаратов в 20 раз превышает количество ТН, вызывающее полное обесцвечивание йодо-азидной смеси.

Объем плазмы, прибавленной к йодо-азйдной смеси

0,02 0,02 0,02

1,0

5,0

50,0

Примечание. Раствор плазмы, содержащей ТН, готовят следующим образом. К 0,25 мл плазмы крови добавляют 0,25 мл раствора с известным содержанием ТН и проводят экстракцию по описанной схеме. Стандартный раствор сравнения готовят следующим образом. К 0,25 мл воды добавляют 0,25 мл раствора ТН той же концентрации и разводят в 100, 500 и 5000 раз.

Таблица 4

Изменение оптической плотности д

1,201 1,152 1,176

Таблица 5

О10

1719974

Таблицаб

Количество плазмы .

крови, мл -.,:. Д Д КОНТР°АЯ

Qj0

1,00,0

1,00,0

.д,.пп -т-

.I

Таблица 7

Проба, взятая„ I I

на анализ, мл Д |С мкг | К С мкг

0,5 0,537 0,542 0,15 80-0,15-12 0,5 0,541 0,5 0,548

Примечание. С- концентрация ТН по графику, К - коэффициент разведения.

Т а б ли ц а 8

Количество тио- Флуоримет-т Предла- пентала в пробе, рический гаемый нгспособ,Ф„-ФК способ,

5,0-0,082

10,00,0400,136

100,00,3980,403

Точность определения при р - 0,95, п 8 4,02% 3,36%

Примечание. Ф,п - флуоресценция пробы; Фк - флуоресценция контроля; Д„ - оптическая плотность пробы; Дк - оптическая плотность контроля.

Составитель С.Рыбалкин Редактор М.Петрова Техред М.ДидыкКорректор Л.Пилипенко

Заказ 768ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат, Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101