Способ определения состояния иммунореактивности Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

ю

оо Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано для определения иммунологических состояний организма. Известен способ определения иммунореактивности лимфоцитов к действию лимфоцитактивных реществ in vitro (левамизола, спленина, зимозана, тимозина и др.) 1. Однако известный способ недостаточно точен, поскольку исключает участие гуморальных факторов в иммунном ответе. Цель изобретения - повышение точности определения состояния иммуннореактивности. Указанная -цель достигается тем, что согласно способу определения состояния иммуннореактивности путем постановки реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана в присутствии стимулятора, одновременно осуществляют реакцию розеткообразования в присутствии аутоплазмы. Способ осуществляют следующим образом. Выделение лимфоцитов проводится в стандартных условиях способа 2. Кровь больных собирают в пробирки, куда предварительно был внесен гепарин (25 ед/мл крови). Затем кровь разводят в соотнощении 1:3 изотоническим буферным раствором, наслаивают на смесь фикола-гипак плотностью 1,077 г/мл и центрифугируют в течение 30 мин при 20° при 400с. Собирают слой клеток с интерфазного слоя и 3 раза буферным раствором. Определяют количество клеток и доводят суспензию до концентрации 2,10/мл клеток. Далее в три конические пробирки вносят по 0,1 мл взвеси лимфоцитов и затем в 1 пробирку вносится 0,1 мл левамизола в концентрации 10мг и 0,1 мл среды, во вторую пробирку - 0,1 мл левамизола и 0,1 мл пазмы крови, в третью пробирку - 0,2 мл среды. Все три пробирки помещают в термостат и инкубируют при 37° в течение 60 мин. Затем пробы один раз центрифугируют при 150 g 5 мин и взвещивают осадки клеток в объеме 0,1 мл. Во все три пробы вносят эритроциты объемом 0,1 мл 0,5%-ной взвеси. Далее пробирки центрифугируют 5 мин при инкубируют 5 мин при 37° в термостате и затем 60 мин при 4°, Затем ресуспензируют и добавляют 0,05 мл 3%-ного гл юта рал ьде гида и через 20 мин 2,0 мл . Центрифугируют, осадок клеток взвещивают в объеме 0,1 мл и наносят на стекло по каплям. После высыхания капель клетки фиксируют метанолом и окрашивают. Подсчитывают процент розеткообразующих клеток в каждой пробе под микроскопом. Пример 1. Больная Г. Оперирована по поводу внутримозговой злокачественной опухоли. Спустя 10 дней взята кровь для исследования. Определение состояния реактивности указанным способом показало, что в первой пробе процент Е-РОК равен 60, во второй с левамизолом - 67%, в третьей с левамизолом и плазмой - 54%. С.аедовательно, у больной имеется относительно чувствительное к иммунной стимуляции состояние иммунной системы, так как в плазме присутствует блокирующий фактор, который снимает эффект стиму.тяции. Пример 2. Больной Ш. Поступил в клинику института с диагнозом: опухоль правой затылочной теменной области. Исследование состояния иммунореактивности до операции показало, что в пробе 1 (контрольной) процент Е-РОК равен 35, а пробе 2 с левамизолом - 41%, а в пробе 3 с левамизолом и плазмой - 23%. Следовательно, у больного в крови имеется блокирующий фактор, снимающий эффект иммуностимуляции in vitro. Состояние иммунореактивности можно оценить как относительно чувствительное к иммуностимуляции. Пример 3. Больная М. Поступила в клинику с диагнозом: опухоль правой лобнотеменной области (глиобластома). Исследование состояния иммунореактивности показало; в пробе -- процент Е-РОК равен 47, в пробе 2 с левамизолом - 48%, Е-РОК в пробе 3 с левамизолом и плазмой - 56%. Следовательно, стимул и pvющий эффект .вамизола проявляется только в присутствии плазмы крови. Состояние иммунореактивности можно оценить как чувствитель стимуляции, Разграничение состояний иммунореактивцости (нечувствительное, чувствительное или относительно чувствительное) основано на различии показаний трех реакций. Количественные показатели этих реакций, на основании которых делается заключение о состоянии иммунореактивности, зависят от воспроизводимости (надежности или точности) способа, Учитывая многолетний опыт работы с этой реакцией, а также разноречивый характер данных об уровне Е-РОК в крови от 35% до 80% Е-РОК у практически здоровых людей в зависимости от способа постановки можно сделать вывод, что разница в показаниях 3-5% не существенная, не достоверная. Различие свыше 6% - достоверное различие в показателях проб. Отсюда: рефрактерное (нечувствительное) состояние, когда в пробах с иммуноактивным веществом процент розеткообразования такой, как в контроле без препарата или на 3-5% выше или ниже; чувствительное состояние, когда в обеих пробах с лимфоактивным веществом количество Е-РОК выше или ниже на 6% и более, чем в контрольной пробе без препарата; относительно чувствительное состояние, когда в пробе с лимфоактивным веществом и плазмой количество Е-РОК ниже на 6% и более, чем в пробе без плазмы. Способ апробирован на 32 больных с черепно-мозговой травмой. При использовании известного и предлагаемого способов получены следующие результаты, представленные в таблице 1. Таким образом, применение двух способов диагностики на одних и тех же больных с черепно-мозговой травмой позволяет их сравнить и оценить. Предлагаемый способ диагностики выявляет группу относительно чувствительных к иммуностимуляцин больных, у которых имеются блокирующие плазменные факторы, способные нивелировать эффект стимуляции. Эта группа относительно чувствительных составляет в данном случае около 40% от всех чувствительных к стимуляции. Тогда как у 60% больных с черепно-мозговой травмой лимфоциты крови стимулируются левамизолом. Но почти у половины из них в плазме имеется блокирующий фактор, который снимает эффект стимуляции. Подобные данные получены и с другими иммуностимуляторами. В подтверждение этого приводится табл. 2, где лимфоциты здоровых лиц (доноры крови) инкубировались совместно с левамизолом, тимозином, спленином, зимозаном в присутствии аутоплазмы или без нее. Как видно из табл. 2 у 4-го и 5-го доноров снижен уровень ТРОК (синоним Т-лимфоцитов) - 28% и 29% соответственно. Следовательно, эти два донора могут рассматриваться как условно здоровые лица, так как у них имеется дефицит количества Т-лимфоцитов в крови. При воздействии левамизола в присутствии аутоплазмы отмечено, что он практически не влияет на уровень Т-РОК клеток у первых трех доноров (колебания в пределах воспроизводимости способа). Тогда как у 4-го и 5-го доноров наблюдается увеличение розеткообразования на 10 и более процентов. Аутоплазма ни в одном из примеров не влияет на стимуляцию левамизолом. При воздействии спленина на лимфоциты доноров наблюдается другая картина, а именно спленин сам по себе без плазмы вызывает угнетение РОК, особенно выраженное у 3-го донора, и усиливает Т- розеткообразование у 4-го и 5-го доноров. В то же время при действии аутоплазмы крови угнетающее действие снленина снижается у 1-го и 3-го донора и не проявляется у 4-го и 5-го донора. Следовательно, спленин оказывает иммуномодулирующее воздействие на лимфоциты и аутоплазма снимает или,усиливает действие спленина. Зимозан также оказывает неоднозначное действие на Е-РОК, и аутоплазма, в свою очередь, коррелирует эффект зимозана. Например зимозан у первого донора усиливает Е-РОК, а у второго и третьего угнетает. Плазма в присутствии зимозана усиливает Е-РОК у первого и четвертого доноров и не влияет на Е-РОК у третьего. Тимоз Ш оказы иммуномодулнруюц ее действие на Е-РОК лимфоцитов, особенно в присутствии плазмы крови, у лиц с низким содержанием Е-РОК происходит увеличение, а у лиц с нормальными значениями нет эффекта. Таким образом, оценка состояний нммунореактивности у пяти доноров с помощью четырех иммуностимуляторов показывает. что предлагаемый способ оценки применим не только к левамизолу, но и к другим препаратам. Таким образом, предлагаемый способ определения состояния иммунореактивности значительно повышает точность и объективность за счет включения в реакцию in vitro плазмы крови, тем самым значитель - расширяется представление о причинах сниженной реактивности и отсутствия эффекта иммуностимулирующих лекарств в организме, тогда как известный способ не позволяет выявлять все формы сниженной иммунореактивности.

« а s е: ю

(О (н

о

tN

чг

о 3о

о

CN

m

СПОСОБ ОП1П-ДЬ:Л1:НИЯ СОСТОЯНИЯ ИММУООРР, АКТИВНОСТИ иутем иоетановки реакции розеткообразова1И1я .лимфоцитов е (ритроцитами бараиа в ирисутетвии стимулятора, отличающийся Tt-M, что, с цел1)К) иовьпнеиия точности ои|)едоле1И1я, одновременно осуществ.пиот реакцию розеткообразования в нрисутствии .1азм1):.

-

ON

1Л ГЛ 1Л m

п

О СМ

-3|Л m п п

CN

п