Способ получения препарата из гипофизов животных для вызывания полиовуляции Советский патент 1992 года по МПК A61K37/32 

15 мин) нерэстворившиеся компоненты железы. Надосадочная жидкость сохраняется. При необходимости можно проводить повторную экстракцию. В этом случае растворимые части объединяются.

В надосадочную жидкость добавляется (NH«)2S04 до концентрации 0.01 М , рН доводится до 3,5 холодной смесью приблизительно 10%-ной ортофосфорной и приблизительно 20%-ной другой органической или минеральной кислоты, например уксусной, в соотношении 1,6:0,25. Через 20 мин проводится центрифугирование (при прежнем режиме). рН супернатанта доводится 2н. NaOH до 6,0 и добавляется сернокислый аммоний до концентрации 1,70 М, оставляется на 2 ч при температуре 2-4°С для формирования осадка. По истечении этого времени смесь центрифугируется (при прежнем режиме). К супернатанту добавляется сернокислый аммоний до концентрации 2,5 М. рН 6,0 (доводится 2н. NaOH). Супернатант оставляется при температуре 2-4°С для формирования осадка, центрифугируется при прежнем режиме. Надосадочная жидкость отбрасывается. Осадок растворяется в минимальном количестве 0.2М раствора двухзамещенного фосфорнокислого калия. Раствор диализуется против воды в течение 12ч при температуре 2-4°С.

Образовавшийся во время диализа осадок отделяется центрифугированием (режим прежний). Прозрачная надосадочная жидкость, содержащая целевой продукт, ли- офилизуется известным способом.

Аналогичные этапы выделения целевого продукта проводят по вариантам 2 и 3 на средние значения параметров и варианту 4 на верхние значения параметров (см. табя.1).

Испытана эффективность оптимального варианта предлагаемого способа выделения целевого препарата из гипофизов животных в сравнении с известным способом. Операции и режимы оптимального варианта приведены в табл.2.

Способ выделения целевого продукта из гипофизов животных(вариантЗ) позволяет получать препарат по биологическому те- сту на неполовозрелых крысах, не уступающий препарату, полученному известным способом (см. табл.3).

Таким образом, при выделении целевого продукта замена синтетического ингибитора протеаз бензамидина на поливалентный природный ингибитор соевых бобов позволила исключить из технологии токсичный и канцерогенный реактив. В связи с этим предлагаемый способ исключил процедуры дозированного нагревания с последующим охлаждением и центрифугированием, в случае оптимального варианта снизил время диализа с 72 до 48 ч, Использование хлористого кальция в сочетании с гидратом окиси натрия вместо свежеприготавливаемой гидроокиси кальция исключило необходимость приготовления этого реактива, а также замена свежеприготавливаемой метафосфор- ной кислоты на смесь фосфорной с другой органической или минеральной кислотой, например уксусной, исключала необходимость приготовления метафосфорной кислоты, при изготовлении которой происходит выделение вредных продуктов, что приводит к исключению из технологии токсичных продуктов, упрощению метода, сокращению его по времени без снижения биологической активности.

Формула изобретения Способ получения препарата из гипофизов животных для вызывания гюлиовуля- ции, включающий измельчение, двукратную

экстракцию в щелочной среде, содержащий ингибитор протеаз, центрифугирование при 4°С. lOOOOg. в течение 15 мин, отделение и объединение надосадочных жидкостей, однократное осаждение сернокислым аммонибм в кислой среде при рН 3,5, а затем двукратное при рН 6,0-8,0, центрифугирование, отделение и растворение осадка в 0,2М двухзамещенном фосфорнокислом калии, диализ раствора, центрифугирование и

лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью снижения трудоемкости способа и исключения токсичных веществ,в качестве ингибитора протеаз в среде экстракции используют природный высокомолекулярный полиспецифический ингибитор из соевых бобов в количестве 0,5-1,5 г на 1 кг ткани железы с добавлением хлористого кальция до концентрации 0,05-0,3 мМ и гидрата окиси натрия до рН 8,0-9,5, а при

осаждении сернокислым аммонием рН доводят до 3,5 смесью 10%-ной ортофосфорной и 20%-ной уксусной кислот, взятых в соотношении 1:0,25-2,0, причем насыщают надосадочную жидкость сернокислым аммонием до 0,01-0.30 м, выдерживают в течение 20-50 мин, а после повторного и третьего осаждения сернокислым аммонием выдерживают 1-24 ч и диализ раствора проводят в течение 12-72 ч вслед за растворением осадка в двухзамещенном фосфорнокислом калии с последующей лиофилизацией отдиализованного раствора препарата.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к эндокринологии животных, и может быть использовано на предприятиях по производству препаратов, вызывающих полиовуляцию, а также в научно-исследовательских учреждениях и отдельных лабораториях для исследовательских целей. Цель изобретения - снижение трудоемкости способа и исключение токсичных веществ. Для этого используют высокомолекулярный полиспецифический ингибитор из Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к эндокринологии животных, и может быть использовано на предприятиях по производству препаратов, вызывающих полиовуляцию, а также в научно-исследовательских учреждениях и отдельных лабораториях для исследовательских целей. Цель изобретения - снижение трудоемкости способа, исключение токсичных веществ. соевых бобов в количестве 1 г на 1 кг железы; CaCI t до концентрации в среде 0,2 мМ и 2 М NaOH для формирования требуемых ионного состава, ионной силы и рН среды до 9,5 в целях создания оптимальных условий экстракции; используют ортофосфор- ную кислоту в смеси с другой минеральной или органической, например уксусной, кислотой для доведения рН среды до 3,5 и первичного фракционирования сульфатом аммония с последующим двукратным осаждением возрастающими концентрациями соли, растворением второго осадка, его диализом и лиофилизацией. Использование ингибитора из соевых бобов предотвращает губительное действие протеолиза на биологически активное начало препарата, исключается .из технологии применение токсичных и канцерогенных реагентов, каковыми являются синтетические ингибиторы протеаз. Использование хлористого кальция в сочетании с гидратом окиси натрия и смеси ортофосфорной с другой органической или минеральной кислотой приводит к упрощению способа и сокращению времени получения препарата без снижения его биологической активности. 3 табл. Замороженные гипофизы измельчаются на холоде в среде с концентрацией СаС12 0,05 мМ и ингибитором протеаз из соевых бобов 0,5 г на 1 кг железы, рН доводится 2н. NaOH до 8,0. Экстракция гипофизов осуществляется в этой же среде (1:2,0j масса/обь- ем) при температуре 2-4°С, с перемешиванием продолжительностью 2 ч. По истечении этого времени осаждаются в рефрежираторной центрифуге (4°С, 10000 д. W Ё ч4 2 N4 00 Os

На холоде

Измельчение

Экстракция: соотношение ткани, и среды

Содержание ингибитора т/кг ткани

CaClj до концентрации, мМ

. рН Время, ч

Центрифугирование (температура, g, время)

Повторная экстракция преципитата в прежней среде:

соотношение ткани и среды

Центрифугирование, режим

В объединенную надоса- дочную жидкость добавляют сухой (NH 4)4804 до концентрации, М

рН доводят смесью 101-ной ортофосфорной и 201-ной уксусной кислот, до рН 3,5, соотношение

время, мин

Центрифугирование, режим

В надосадочнуо жидкость вносят сухой ( Д° конечной концентрации, М

рН время, ч

Центрифугирование, режим

1:2,5 1:3,0

0,75

1

0,150,20

8,59,0

2,53,0

10000, 15мин

1:М 1,5

0,30 9,5 «, 5

1:1,5 1:2,0 1:2,0 1:2,5

прежний

0,010,10 0,20

0,30

1:1 АО

1,3 7,5 Ю

1:2 50

1,35

8,0

2k

I

......... .Продолжение табл. 1

..........j.L...:::r..:.:ir..:::::::::

В надосадочную жидкость (добавляют сухой (NH4)tSO до конечной концентра- 1ции, М

рН

время, ч

Центрифугирование, режим

Осадок растворяют в 0,2М К2НР04

Диализ против воды, время, ч

Центрифугирование, режим

Лиофилизация адосадоч- ной жидкости

прежний

ооЧем минимальный

прежний известным1способом

Примечание. Все процедуры проводятся притемпературе

. Наивысшая активностьпрепарата по

биологическому тесту вариант3 (табл.3).

ингибитор

а) бензамидин, мМ

6J соевый, г/кг ткани железы

СаС1

€

Н

2н. NaOH время, ч

Центрифугирование, (температура, g, время)

72

5,0

ЬО

0,20

до рН 9,0

3,0

VC, 10000, 15 мин

14центрифугирование, режим

15Диализ раствора против воды, ч

16Центрифугирование, режим

17Лиофилизация, способ

Примечание. Все продукты ведут при температуре 2-1 С,

конечный продукт представляет собой лиофи- лизованный препарат.

Та б л и цаЗ

Активность препаратов, приготовленных по известному и различным вариантам предлагаемого способа

прежний

прежний

72

прежнийпрежний известный известный