Способ получения пролактина человека из гипофиза Советский патент 1993 года по МПК A61K35/30 

Изобретение относится к области медицины, а именно, к получению белкового гормона человека пролактина, входящего в качестве ключевого реагента в иммунохими- ческие аналитические системы для количественного определения этого гормона. Оно может быть использовано в медицине при создании и производстве наборов реагентов для определения концентрации пролактина в крови и других биологических жидкостях с целью диагностики и при контроле за ходом лечения эндокринных заболеваний.

Цель изобретения - получение пролактина человека с сохранением его нативных иммунологических свойств и с высоким выходом, что обусловливает высокое качество

и уменьшение стоимости диагностических систем иммуноанализа этого гормона.

Цель достигается применением нового способа выделения пролактина, в котором полностью исключается использование органических растворителей и применена новая процедура щелочной экстракции. Свежезамороженные гипофизы гомогенизируют и извлекают из них гликопротеины и балластные белки путем духкратной экстракции кислым буферным раствором без использования этанола. Из остатка ткани, который не высушивают ацетоном, как в прототипе, получают щелочной экстракт. Для этого ткань экстрагируют в течение 15 минут 0,1 н раствором NaOH при 35°, а затем быстро охлаждают смесь, закисляют до

00

«о VI

ю

(Л

Qs

рИ 9,5 соляной кислотой и. в отличие от прототипа, экстракт не отделяют, а продолжают экстракцию в течение 15-17 часов при температуре 4°, то есть в более мягких условиях. Экстракт отдел я ют, а содержащийся в нем пролактин подвергают очистке путем ионообменной хроматографии и гельфильт- рации, так же как это делается в способе- прототипе.

Заявляемый способ выделения пролак- тина человека имеет существенные отличия от прототипа и других аналогичных способов, поскольку новая совокупность примененных в нем приемов позволяет увеличить выход и улучшить качество конечного продукта. В серии из трех выделений заявляемым способом выход пролактина составил 12-57 мкг на 1 гипофиз {в прототипе 8-35 мкг) при активности 48-80 МЕ/мг (в прототипе 25-35.6 МЕмг). Таким образом, наибольшаявеличинаудельнойиммунологической активности пролактина, получаемого заявляемым способом, в два раза превосходит величину иммунореактив- ности лучших препаратов пролактина, получаемых в настоящее время другими способами и используемых в лучших мировых образцах иммунохимических аналитических систем (7, 8).

Пример 1. Выделение пролактина заявляемым способом.

Замороженные гипофизы человека (секционный материал) в количестве 122 штук, 61 г, гомогенизировали в 0,15 М цитратфос- фатном буфере, рН 4.0, а затем, доводили объем до 0,8 л и перемешивали гомогенат в том же растворе 30 мин при температуре 4°. Экстракт отделяли путем центрифугирования, а осадок экстрагировали повторно, как в первый раз. Осадок после отделения второго кислого экстракта суспендировали в 450 мл воды, подогретой до 35°, добавляли 50 мл 1 н NaOH и перемешивали при 35° в течение 15 мин. Смесь затем быстро охлаждали, подкисляли до рН 9,5 с помощью НО, добавляли в нее ингибитор протеаз фенил- метилсульфонилфторид до концентрации 0,15 мМ и оставляли до следующего дня на 15-17 ч в холодной комнате при температуре 4° при перемешивании магнитной мешалкой. Осадок отделяли от щелочного экстракта путем центрифугирования и дважды промывали порциями по 50 мл буферного раствора 10 мМ Трис-HCI, 100 мМ NaCl. рН 8,5 с последующим центрифугированием, Три порции щелочного экстракта объединяли, доводили рН смеси до 8,5 с помощью НС и сразу же наносили на колонку (2,6x90} см с ДЭАЭ-Сефарозой CL6B (Фармция, Швеция), уравновешенную тем

же раствором. Элюцию колонки проводили до полного исчезновения белка в элюэте. Фракции, содержащие максимальное количество иммунологически активного пролактина, объединяли, разбавляли в 2 раза водой и наносили после доведения рН до 5,6 на колонку (1,6x15) см с карбоксиметилцел- люлозой СМ-,23 (Ватман, Великобритания), уравновешенную 10 мМ ацетатом аммония,

рН 5,6, Колонку с сорбированным пролакти- ном промывали последним из указанных буферов с добавлением 50 мМ Nad. Затем элюироаали пролактин 0,1 М бикарбонатом аммония при скорости тока 20 мл/час. Элю5 ат, содержащий пролактин, концентрировали до объема 10 мл при помощи погружаемого ультрафильтрационного патрона СХ 10 (Миллипор, США) и наносили на колонку (2,5x90) см с Сефадексом G 100 су0 перфайн (Фармаци, Швеция). Элюцию колонки проводили восходящим током 0.1 М бикарбоната аммония при скорости 8 мл/час. Фракции, содержащие пик иммуно- реактивного прояактина, объединяли, В ко5 нечный продукт, имеющий концентрацию белка 0,25 мг/мл добавляли сахарозу из расчета 50 мг на 1 мг белка, после чего продукт аликвотировали и хранили в замороженном состоянии. Концентрацию белка в процессе

0 выделения и в конечном продукте определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, принимая, что AICM для 1 , Конечный выход продукта составил 7 мг или 57 мкг в расчете на 1 гипофиз. Исследование

5 препарата методом электрофореза в поли- акриламидном геле с окраской белка серебром (12, 13) и иммуноблотингом (14) не выявило в препарате присутствия иных белков, кроме иммунореактивного пролактина.

0 Иммунореактивность препарата исследовали с помощью двух различных радиоиммунологических систем: набором реагентов фирмы Фармос Диагностика (Финляндия) (7) и тест-системы Всемирной организации

5 здравоохранения. В обеих системах были получены одинаковые результаты. Выход иммунологически активного пролактина составил 560 ME (из 122 желез) при удельной иммунологической активности 80 МЕ/мг

0 белка.

Пример 2. Выделение пролактина заявленным способом,

. В опыт взято 120 свежезамороженных гипофиза общим весом 74 г. Дальнейший

5 ход выделения не отличается от описанного в примере 1. Величины поэтапного выхода белка и иммунореактиеного пролактина приведены в таблице 1, Конечный выход продукта - 4,5 мг. то есть 37,5 мкг на 1 гипофиз. Концентрация белка в конечном

продукте - 0,22 мг/мл (А1См280). Величина иммуологической активности конечного продукта - 48,0 МЕ/мг белка,

Пример выделения пролактина способом-прототипом.

Свежезамороженные гипофизы в количестве 1.000 штук весом 525 г гомогенизировали при 4° порциями по 200 штук в смеси 10% ацетата аммония. рН 5,1 и абсолютного этанола в соотношении 60:40. Объем смеси 1 л. Порции гомогената объединяли и оставляли, перемешивая, на ночь в холодной комнате. Утром следующего дня осадок отделяли центрифугированием или фильтрованием через бумагу, заливали его 0,5 л свежей смеси ацетата аммония с этанолом и продолжали экстракцию 2 часа при перемешивании и охлаждении. Осадок вновь отделяли и промывали на фильтре 0,5 л этанола. Спирт после промывки осадка объ- единяли с двумя порциями аммонийно- спиртового кислого экстракта и сохраняли для выделения гонадотропинов. Осадок обезвоживали на фильтре путем промывки восемью порциями по 0,5 л холодного аце- тата и высушивали при комнатной температуре на бумаге в вытяжном шкафу. Вес сухого осадка 87,3 г.

Для выделения пролактина 10 г сухого осадка, что соответствует примерно 114 ги- пофизам, суспендировали в -450 мл воды, подогретой до 35°, добавляли 50 мл 1 н NaOH и экстрагировали при 35° 15 мин. Затем смесь быстро охлаждали на льду, одновременно подкисляя ее соляной кислотой до рН 9,5, центрифугировали л доводили надосадочную жидкость (щелочной экс- тракт) до рН 8,5. Осадок дважды промывали порциями по 50 мл буферного раствора 10 мМ Трис-HCI, 100 мМ NaCI, рН 8,5, добавляли ингибитор протеаз фенилметилсульфо- нилфторид до 0,15 мМ и сразу накосили на колонку (2,6x90) см с ДЭАЭ-Сефарозой CL 6В. Дальнейший ход выделения пролактина не отличался от описанного в примере 1. Величины поэтапного выхода общего белка и иммунорективного пролактина прмведе-

ны в таблице 1. После гельфильтрации получено 158 мл раствора белка с концентрацией 0,18 мг/мл (А1см280 -1.1 мг/мл). Препарат сконцентрирован с помощью патрона СХ 10 до концентрации белка 0,2 мг/мл. Выход пролактина составил 2,84 мг или 24,9 мкг на 1 гипофиз. Иммунологическая активность - 29.7 МЕ/мг белка, Поста- дийный выход общего белка и иммунореактивного пролактина при выделении пролактина из свежезамороженных гипофизов способом-прототипом и заявляемым способом в расчете на 1 гипофиз.

Предлагаемый способ получения пролактина человека обладает следующими технико-экономическими преимуществами по сравнению с прототипом и аналогами:

1)повышается качество целевого продукта, так как получается пролактин, имеющий более высокую удельную иммунологическую активность;

2)повышается эффективность выделения, поскольку увеличивается конечный выход гормона в расчете на 1 гипофиз;

3)обеспечивается создание более высококачественных иммуноаналитических диагностических наборов при уменьшении их стоимости.

Формула изобретения

Способ получения пролактина человека из гипофиза, включающий измельчение свежезамороженного сырья, гомогенизацию в кислой среде, отделение остатка ткани, его экстракцию в NaOH при 35°С в течение 15 мин, охлаждение смеси, подкисление ее до рН 9,5, центрифугирование, доведение рН экстракта, содержащего, целевой продукт, до 8,5 г. последующей его очисткой хроматографией, о т л и ч э кГщ и и с я тем, что, с целью повышения выхода и специфической активности целевого продукта, перед центрифуги- рованием смеси в нее добавляют ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид до концентрации 0,15 мм и перемешивают 15- 17 ч при 4°С.

Способ получения пролактина человека из гипофизов, используемый при создании и производстве медицинских иммуноэнали- тических наборов реагентов для измерения уровня пролактина с целью диагностики и контроля эффективности лечения эндокринных заболеваний. Целью изобретения является повышение выхода и специфической активности целевого продукта. Это достигается способом выделения пролактина из свежезамороженных гипофиз, который включает кислую водную экстракцию гли- копротеинов и других побочных белков, продолжительную духстадийную щелочную экстракцию пролактина, очистку пролактина из щелочного экстракта, колоночной хро- матографией на анионообменнике, катионообменнике и гельфильтрацию. Новым в способе является полный отказ от использования органических растворителей в сочетании с применением двухстадий- ной процедуры щелочной экстракции ткани, которая включает 15-минутную экстракцию 0,1 н. NaOH при 35° и следующую за ней длительную экстракцию в течение 15-17 ч при рН 9,5 и температуре 4°С. Способ может также найти применение при научных исследованиях строения и свойств пролактина человека. 1 табл.