Способ получения фитогемагглютинина Советский патент 1977 года по МПК A61K35/78 

i . .

, Изобретение ОТНОСИТСЯ к способам получения биологически активных веществ, которые могут найти применение в биологии и.медицине в качестве стимуляторов митозов в культуре кчеток, а также как стимулятор |Кроветворенйя при введении в организм.

Известен способ получения фитбгемагглк инийа из муки различньге сортов фасоли пу:тем высаливания из раствора целевого про;дукта сульфатом аммония в кислом значении рН, диализа, добавления солей и окончательным отделениеМфитслгемагглю ининав ацетоне с последуюшей стерилизацией и концентрированием продукта.

Однако такой способ не обеспечивает высокой ЧИСТОТЫ и активности целевого про дукта.

С целью повышения чистоты/и активное:-. ти целевого продукта по предлагаемому ciioсобу в качестве источника сырья исполь«зуют сорта фасоли, имеющие белые почковидные бобы, из которых после экстракции выделяют фитогемагглютинин путем обработки раствора экстрактом щитовидной железы, затем осадок растворяют в воде, нейтрайизуют, после Диализе добавляют .хлорнотый кальций и хлористый марганеа.

Для получения митогенноактивных препаратов фитогемагглютининов пригодны сорта фасоли, имеющие белые почковидные бобы со средними размерами 16x8x5,2 мм н весом 400-50О г йа 1 Ттыс. семяи.

Размол бобов фасоли проводят на гомргйнизаторе типа кофемолки с достаточной пропускной способностью или на жерновой мельнице. Для Хорошего выхода препарата padMap частиц муки не более 0,5 мм.

3 кг фасолевой муки экстрагируют 15 л 1%-Ного раствора хлористого, натрия при постоянном перемешивании I я. Центрифугируют 15 мин при ЗООО об/мин. Надосадочную жидкость доводят до . рН 4 концентрированной СГ1ЛЯНОЙ кислотой, и осадок даляют центрифугированием 20 мин. Надосадочную жидкость доводят до рН 8 раствором едкрго натра и осадок удаляют центрифугированием 15 мин. Надосадочиую жидкость собирают и доводят до рН 6,5 концентрированной соляной кислотой.

К надосалочной жидкости добавляют 9ОО мл экстракта щитовидной железы. Смесоставляют на 0,5 -2 ч, после чего осадок собирают центрифугированием 15 мин .при ЗООО об/мин. Осадок отмывают 3 раза тр&хкратным объемом холодного физраствора.

Экстракт щитовидной железы получают путем размалывания щитовидных желез крупного рогатого скота на мясорубке экстрагирования 2 ч трехкратным объемом физраствора и центрифугирования 15 мин нри ЗООО об/мин.

Осадок, полученный на предьщущей стадии, размешивают в воде до объема 80О1ООО мл и доводят до рН 3 концентрированной соляной кислотой. К раствору добавляют сульфат аммония из расчета 550 г/л и корректируют рН до. 3. Осадок собир&ют центрифугированием-15 мин при 6000 оё/мин Затем осадок размешиватот в трехкратном, объеме воды, доводят до рН 3 и центрифугируют 15 мин при 6ООО об/мин. К полученной надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония из расчета 400-450 г/л. Осадок собирают центрифуг«рс анием 2Омин при 6ООО об/мин, растворяют его в 100мл воды и доводят до рН 7. Полученный раствор диализуют против дистиллированной во|ды 24 ч при 4с. При этом часть белка выпадает в осадок. К полученной таким образом суспензии добавляют из расчета на 10О мл 1 г хлористого натрия 200 мг хлористого кальция и 5О мг хлористого марганца,, после чего диализуют еще 12ч

против 1 % хлористого натрия. По OKOHffiнии диализа раствор центрифугируют для удаления небольшого осадка, стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейца, стерильно фасуют во флаконы по 10 мг белка и лиофилизуют.

Выход продукта 2-2,5 г из 1 кг сырья. Полученный фи гемагглютинин облада РТ митогенной активностью, обеспечивающей

не менее 15О метафазных пластинок на 10О мкг ФГА и вызывают балластное превращение не менее 75% лимфоцитов в культуре.

Предлагаемый способ обеспечивает увеличение выхода продукта в 3-4 раза с высокой степенью чйстотыИ активностью продукта.

Формула изобретения

Способ получения фитогемагглютинина путем экстракции фасолевой муки раствором .хлористого натрия и последующим вььсаливанием сульфатом аммония и диализом, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты и активности целевого продукта, в качестве источника сырья исползуют сорта фасоли; имеющие белые почковидные бобы, из которых после экстракции вьщеляют фитогемагглютинин путем обработки раствора экстрактом щитовидной железы, затем осадок растворяют в воде, нейтрализуют после диализа добавляют хлористый кальций и .хлористый марганец.