Штамм бактерий YeRSINIa рSеUDотUвеRсULоSIS I серовара, используемый для изготовления протективного антигена Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 A61K39/102 

(Л

С

Использование: медицинская микробиология, аттенуированный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, протективный антиген, псевдомоноз. Сущность изобретения: штамм Yerstnlapseudotuberculosls I ce- ровара Ns 623 KV 9/2 обладает выраженной иммуногенной активностью и протективно- стьго. Штамм представляет собой аттенуированный двухмаркерный мутант, защищающий экспериментальных животных от развития псевдотуберкулезной инфекции. , Штамм (№ 175) депонирован в коллекцию музея живых культур Государственного НИ- ИСК медицинских биологических препаратов МЗ СССР им. Л.А.Тарасевича.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный аттенуированный штамм возбудителя псевдотуберкулеза наиболее распространенного серовара в качестве протективногр антигена.

Цель изобретения - штамм Y.pseudotuberculosts I серовара № 623 К 9/2, обладающий выраженной иммуногенной активностью и протёктивностью.

Он представляет собой аттенуированный двухмаркерный мутант - кальцийнеза- висимый вариант, несущий маркеры устойчивости к налидиксовой кислоте (ДНК- гираза) и кристаллвиолету (белки наружной мембраны).

Штамм депонирован в коллекцию музея живых культур Государственного НИЙСК медицинских биологических препаратов МЗ СССР.

Морфологическая характеристика. Бактерии на мясопептонном агаре рН 7,2 при 22°С образуют круглые выпуклые с исчерченным центром колонии, формирующиеся в течение 48 ч, В бульоне - равномерное помутнение, на дне пробирки незначительный осадок. В мазках - грамотрицательные палочки. Бактерии подвижны при выращивании в 0,3-0.5% агаре при 22°С. Иерси.нии хорошо растут на минимальном агаре с глюкозой. Формирование колоний наблюдается через 16-18 ч при выращивании при 37°С и через 48 ч при 22°С.

ю о о

xj

ел

Биохимическая активность. Иерсинии ферментируют глюкозу, галактозу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, маннит и глицерин. Редуцируют нитраты. Уреазоположи- тельны. Не расщепляют сахарозу, лактозу, раффинозу, дульцит, инозит, сорбит, Не образуют индола и сероводорода, не обладают гемолитическими, ллазмокоагулирую- щими и фибринолитическими свойствами. Не утилизируют цитрат. Не активны в отношении аргинина, лизина иорнитина.

Антигенные свойства. Вступает в реакцию агглютинации с псевдотуберкулезной сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов эталонным штаммом Y.ps.eudotuberculosls I серовэра из международной коллекции,

Бактерии лизируются поливалентным псевдотуберкулезным бактериофагом, не .чувствительны к действию фага Л-413, С и Покровской.

Генетические особенности. Бактерии утратили плазмиду 47 МД, контролирующую кальцийзависимость и синтез VW-анти- генов. Бактерии несут маркеры устойчивости к налидиксовой кислоте и кристаллвиолету, что позволяет дифференцировать их от штаммов естественного происхождения. В некоторых случаях у бактерий может обнаруживаться крупномолекулярная плазмида (криптическая), выявляемая при электрофо- ретическом излучении профиля плазмидной ДНК в 0,7% агарозе.

Патогенные свойства. В отличие от родительского штамм N; 623 К V9/2 безвреден для лабораторных животных: не вызывает гибели белых мышей, зараженных дозой 1x10 внутрибрюшинно, голодающих морских свинок, зараженных энтерально дозой ЗхЮ9. При однократном введении энтерально голодавшим в течение 4 суток морским свинкам 109 бактерий обнаруживаются в области пейеровых бляшек терминальной подвздошной и слепой кишок, вызывая в лимфоидной ткани последних и в мезеитериальных лимфоузлах гиперплазию и появление специфических для псевдотуберкулезной инфекции эпите- ;лиоидных гранулем, Однако эти бактерии быстро гибнут, не вызывая даже лейкоцитарной реакции.

Штамм не восстанавливает вирулент- ных свойств при 10-кратном пассировании через организм белых мышей. Безопасность штамма генетически обеспечена: отсутствует плазмида 47 МД и связанные с ней некоторые признаки вирулентности - аутоагглютинация и кальцийзависимость. Бактерии обладают двумя мутациями, связанными с аттенуацией (устойчивость к налидиксовой кислоте и кристаллвиолету).

Иммуногенная активность и протектив- ность. При иммунизации кроликов по смешанной схеме 4-х кратно в дозе 14 млрд.м.к. № 623 К v 9/2 формировал выраженный иммунный ответ (средний титр антител 1:3200), У морских свинок значительную концентрацию специфических антител

0 (средний титр 1:800) выявляли после 3-ей иммунизации; на этом сроке отмечен выраженный протективный эффект. Заражение . морских свинок 1000 ЛД50 вирулентного штамма приводило к выявлению иерсиний в

5 кишечнике в концентрации 2,5х102 на 1 г органа только на 3-й сутки после заражения. При этом в органах и тканях отсутствовали морфологические изменения. Использование штамма № 623 К v 9/2 осуществляется

0 следующим образом.

Чистую культуру штамма выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хот- тингера) при 22°С в течение 48 ч. С помощью 0.85%-го раствора хлорида натрия смывают

5 клетки с агара и дважды отмывают их в том же растворе путем центрифугирования (5000 об.х15 мин). Затем суспензию используют для иммунизации лабораторных животных в виде живой культуры либо после ее

0 обработки (инактивации) формалином 30%- ой концентрации на 5 млрд; м.к. в течение 18-20 ч. Суспензию двукратно отмывают от формалина стерильным 0,85%-ом раствором хлорида натрия путем центрифугирова5 ния при 5000 об./мин х 15 мин. Перед использованием концентрацию клеток в суспензии доводят по оптическому стандарту мутности до 109 м.к./мл.

П р и м е р 1. Иммунизацию кроликов

0 проводят по смешанной схеме 4-кратно: 1-я иммунизация - внутривенно в дозе 4 млрд. м.к., 2-я - внутримышечно в дозе 2 млрд. м.к. через четверо суток, 3-я - смешанная в дозе б млрд. м.к. (по 2 млрд. м.к. внутривенно,

5 внутримышечно, в область лимфатического . узла) через 7 суток. 4-я внутривенно в дозе 2 млрд.м.к. через 7 суток.

Через 7 суток после 4-ой иммунизации берут кровь из краевой вены уха кролика и

0 исследуют сыворотку в разведении 1:40 - 1:6400 в реакции агглютинации по общепринятой методике. Как правило, выявляется титр специфических антител не ниже 3200, что свидетельствует о выраженной имму5 ногенности штамма и обосновывает перспективность его использования для конструктирования вакцины.

П р и м е. р 2. Иммунизацию морских свинок проводят 3-кратно с интервалами в 7 дней в дозе по 10 м.к. на каждую иммуни

зацию. После 3-ей иммунизации с сыворотками животных ставят реакцию агглютинации по общепринятой методике, смешивая по 0,5 мл культуры штамма (10 м.к./мл) с такими же объемами сыворотки в разбеде- ниях от 1:20 до 1:800. При содержании специфических антител в титре не ниже 1:400 проводят посев 1 заражение высоковирулентным штаммом путем введения энте- рально через зонд возбудителя в дозе ЗхЮ9 м.к. Через 3,6,9,14 суток проводят вскрытие животных и забор проб из органов и тканей. После их гомогенизации (1 г каждой пробы) в 1 мл физиологического раствора осуществляют посев (по 1 мл) в среду накопления БКД или фосфатно-буферную среду, в которых выдерживают в условиях холодильника. В сроки - на 3,5,7 сутки осуществляют посев (по 0.1 мл каждой пробы) на плотную питательную среду (МПА или Хоттингера. Через 48 ч подсчитывают количество выросших колоний в 1 г исследуемого материала,

Специфическая протективность штамма № 623 KV 9/2 реализуется тем. что не наступает диссеминации вирулентного штамма в органы и ткани, з высев иерсиний

наблюдается из испражнений и кишечника в ранние (не позднее 6 суток) сроки после заражения.

Таким образом, полученный мутант Y.pseudotuberculosls I 623 KV 9/2 обладает

низкой остаточной вирулентностью, выраженной иммунологической специфичностью, защищает экспериментальных животных от развития псевдотуберкулезной инфекции и может быть предложен в

качестве перспективного конструирования вакцины.

Формула изобретения

Штамм бактерий Yersinla pseudotuberculosls I серовара ГИСК № 175, используемый для изготовления протективного антигена.