Способ получения бактериального ферментного препарата Советский патент 1992 года по МПК C12N9/28 

Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности, а именно к способам получения сухого бактериального ферментного препарата, содержащего а-амилазу.

Известны способы получения сухих .ферментных препаратов, содержащих комплекс амилолитических ферментов, предусматривающие ультрафильтрацию культуральной жидкости с последующей сушкой полученного концентрата распылением.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сухого бактериального ферментного препарата, предусматривающий культивирование продуцента

бактериальной а -амилазы вид а Bacillus subtilis с последующим концентрированием культуральной жидкости сушкой в присутствии наполнителя. В качестве наполнителя по известному способу используют NaCI.

Недостатком этого способа являются большие потери активности - около 20% от исходной, а также то, что полученный препарат обладает лишь амилолитической активностью, что ограничивает сферу его применения, так как в спиртовой промышленности наряду с амилолитическими ферментами целесообразно использовать целлюлазу,. гемицеллюлоазу, уЗ-глюканазу, а также ксиланазу и пуллуланазу, спасобствующие расщеплению белков и некрахмалистых составных частей зерна и картофеля.

. Цель изобретения - повышение стабильности активности а-амилазы при хранении.5

Предлагаемый способ предусматривает сушку культуральной жидкости Bacillus subtiiis, содержащей а-амилазу, в присутствии наполнителя-стабилизатора, в качест- 10 пе которого используют муку злаковых,

вводимую 0 КуЛЬТураЛЬНуЮ жидкость в COOT

ношении 4:1, причем муку разделяют на две части в соотношении 1:20, меньшую из которых смешивают с культуральной жидко- 15 стью по окончании процесса культивирования, а большую добавляют перед сушкой.

Целесообразно для обогащения культуральной жидкости наря,цу с амилазой комплексом других ферментов - /J-глюконазой, 20 целлюлазой, целлобиазой и ксиланазой -перед сушкой с мукой вводить в культуральную жидкость солод в соотношении 1:8 к муке. Мука в данном случае при сушке препарата играет роль стабилизируюидего ком- 25 понента, так как содержит ионы Мд и Са а также углеводы в виде крахмала и Сахаров. Муки злакои является богатым источником минеральных вещесто (средняя зольность культур составляет 1,24-2,67%), главная 30 часть которых представлена фосфором, калием, кальцием, магнием, железом. Кроме отмеченных выше в зерне имеется целый ряд других элементов: Na, А1, Ti, Мп и др.

Катионы таких металлов, как Мд , Na, 35 , Сг, Со оказывают сильное стимулируюа;ее действие на каталитическую актипиость фермента.

Ионы кальция в этом эффекте играют определяющую роль, что обьясняется осо- 40 бенностями структурного строения молеку лы сг-амилазы. Как известно, нативная конфигурация полипептидной цепи а-амилазы Вас.subtiiis поддерживается водородными связями между ОН-группами 45 тирозина и СООН-группами дикарбоновых кислот, а также поперечными связями, которые образуются при участии ионов кальция. Удаление атомов кальция из белка вызывает интенсивное разрушение третичной 50 структуры фермента и его каталитического центра. В присутствии кальция а-амилаза вполне устойчива к экстремальным зиачениям температуры и рН, обработке мочевиной и воздействию протеаз. Повышение 55 Содержания кальция в реакционной среде предотвращает денатурирующее действие ионов тяжелых металлов, источником которых в производственных условиях могут

быть некоторые реактивы, вода, стенки долгоэксплуатируемых ферментаторов.

При введении части муки по окончании процесса выращивания образуется фермент-субстратный комплекс, так как благодаря стабилизирующему действию кальция образуются дополнительные внутримолекулярные связи, так как присоединяющийся к полипептидной цепи Са ион оказывает на цепь сильное направленное действие, приводящее к закручиванию, а фермент приобретает соответствующую стабильность. Этот эффект еще более усиливается при добавлении в культу рал ьную жидкость второй части муки к образовавшемуся ферментсубстратному комплексу. В этом случае стабилизирующее действие на каталитическую активность оказывает, с одной стороны, крахмал как специфичный для а-амилазы субстрат, с другой стороны, - ионы металлов, в частности калия, магния, кальциия.

Стабилизирующий эффект особенно важен в данном случае, поскольку процесс обезвоживания (сушки) смеси происходит при 55-60°С, являющейся критической относительно термостабильности а-амилазы Вас.subtiiis. Таким образом, мука впервые используется по новому назначению - как стабилизатор.

Ферментативная активность препарата возрастает при добавлении солода в смесь и культуральной жидкости.

Ферментный комплекст солода представлен такими ферментами, как а-амилаза, )б-амилаза, декстриназа. Среди ферментов солода важная роль принадлежит также целлюлазам, гемицеллюлазам и пектиназам, расщепляющим соответствующие субстраты при ферментативной обработке сырья до сбраживаемых Сахаров.

При получении указанных смесей повышается о.смотическое давление, что препятствует развитию посторонней микрофлоры и способствует повышению стабильности получаемого гфепарата.

Таким образом, при введении муки в определенном соотношении и на определенных стадиях в культура л ьную жидкость повышается стабильность при сушке и хранении препарата, Этот эффект проявляется после введения муки и усиливается введением солода, который наряду с о:-амилазой содержит комплекс других ферментов.

П р и м е р 1. Осуществляют глубинное культивирование продуцента а-амилазы Bac.subtills-82 на среде следующего состава, мае.%:

Кукурузная мука9,0

Кукурузный экстракт2,0

Мочевина0.45

Сульфат аммония0,3

Мел0,5

Культивирование осуществляли в ферментаторе вместимостью 32 м , коэффициентом загрузки 0,5 в течение 48 ч при 35°С и интенсивном перемешивании культуры.

Получаемая культуральная жидкость в количестве 15 м имеет активность о:-амилазы ЮОед/мл.

Муку приготавливают дробление. зерна до не менее чем 85%-го прохода через сито с диаметром отверстий 1 мм. Полученную муку разделяют на две части в соотношении 1:20. К 15 м культуральной жидкости с активностью 100 ед/мл добавили 2,8 т мухи, смесь перемешали и выдержали в течение 10 мин, затем добавили 57,2 т вторую честь муки. Смесь гранулируют и подвергают сушке при 55°С в течение 40 мин до влажности 10%.

П р и м е р 2. Процесс культивирования, подготовку и введение муки осуществляли по npiMepy 1, только перед сушкой к смеси купьтуральной жидкости и муки ввели солод в количестве 7,5 т (соотношение муки с солодом 8:1).

Все показатели процесса приведены в табл.1 из расчета на 1 м культуральной жидкости.

П р и м е р 3. Процесс культивирования и сушки вели по примеру 1, только использовали муку ржаную. Показатели процесса и характеристики готового продукта аналогичны приведенным в примере 1.

Приме р 4. Процесс культивирования и сушки вели по примеру 1, только использозали муку ячменную. Показатели процесса и характеристики продукта аналогичны приведенным в примере 1.

П р и м е р 5, Все по примеру 2, только в качестве муки использовали ржаную муку, а в качестве продудента фермента Bac.mesentericus с активностью о:-амилазы 40 ед/мл культуральной жидкости. Показатели процесса приведены в табл.2.

При использовании кукурузной муки показатели также аналогичны приведенным в примере 1.

В табл.3 приведены показатели активности до и после сушки при разоличкых соотношениях муки и культуральной жидкости.

В табл.4 приведены показатели ферментативной активности после различных сроков хранения.

Сухой бактериальный препарат, получае ый по предлагаемому способу, обладает высокой стабильностью. Хранение при 25°С Б течение 2 мес приводило к потере активности ферментов лишь на 2-6% (табл.4), в дальнейшем темпы падения активности были незначительными и через 4 мес активность препарата составила 88-95% от исходной. .

В табл.Б представлены данные, демонстрирующие преимущества предлагаемого способа в сравнении с прототипом.

Таким образом, предлагаемы способ обеспечивает получение сухого бактериального препарата, обладающего высокой ферментативной активностью.

Формула изобретения

1. Способ получения бактериального

ферментного препарата из культуральной жидкости Bacillus subtiHs, содержащей а -амилазу путем ее сушки в присутствии наполнителя, отличающийся тем, что,

с целью повышения стабильности активности а -амилазы при хранении, в качестве наполнителя используют муку злаковых, вводимую в культуральную жидкость в соотношении 4:1, причем муку разделяют на две

части в соотношении 1:20, меньшую из которых смешивают с культуральной жидкостью, а оставшуюся вводят в полученную смесь перед сушкой.

2. Способ по п.1,отличающийся

тем, что перед сушкой в смесь дополнительно вводят солод в соотношении 1:8 к муке.

Таблица 1

Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности, аименно к способам получения сухого бактериального ферментного препарата, содержащего а -амилазу. Цель изобретения - повышение стабильности активности а -амилазы при хранении. Способ предусматривает сушку культуральной жидкости Bacillus subtilis, содержащей а -амилазу в присутствии наполнителя - стабилизатора, в качестве которго используют муку злаковых, вводимую в культуральную жидкость в соотношении 4; 1, причем муку разделяют на две части в соотношении 1:20, меньшую из которых смешивают с культуральной жидкостью, а большую добавляют перед сушкой. Для обогащения препарата комплексом других ферментов, а именно ^3-глюканазой, целлюлазой, целлобиазой и ксиланазой, перед сушкой в смесь вводят солод в соотношении 1:8 к муке, Сухой препарат обладает высокой активностью и стабильностью. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

Продолжение табл.1

Таблица 2

Продолжение табл.2

Таблица 3

Таблица 4

1708840

11 Т а б л и ц а 5