на env: Bgl II (7071) - Bgl 11 (7651) (276-466) и Bgl II (7651) - Bam Ht a. k(467-750).
Рекомбинантный белок, кодируемый плазмидой, содержащей Bgl 1.T - Bam Hi фрагмент, обладал высокой антигенной активностью в условиях иммуноблотинга. Од- на ко рекомбинантный белок, содержащий полипептид, кодируемый фрагментом Bglll- Bglll, в состав которого входит область с 428 по 443 аминокислоту белка др 120, антигенными свойствами не обладал.
В другой работе тот же самый Bg ill (7071) - Bg ill (7651) фрагмент клонирован в составе экспреесионноговектора pJM, содержащего промотор-оператор м ген trp E триптофанового оперона Е coll.
К основному недостатку описанного аналога следует отнести отсутствие анти- ге.нной активности у рекомбинантного белка, несущего полипептид, кодируемый Bgl II - Bgl II фрагментом гена env ВЙЧ-1.
Известна пдазмйда pENV 83, содержащая слитый с началом гена /3-галоктозида- зы природный фрагмент ДНК гена env БИЧ-1 размером 1240 н. п., включающий фрагмент, кодирующий область (428-443 а. к.), Полученный гибридный белок узнает антитела к ВИЧ-1 в сыворотках больных СПИ- Дом в тесте EL1SA и предлагается авторами для диагностических тест-систем.
Недостатком, рекомбинантной плазми- ды pENV 83 является использование потен- циально опасного чужеродного генетического материала для ее конструирования, а также наличие в ее основе не- скольких антигеннозначимых участков белков др 120 и др 41.
Таким образом, близких аналогов, описывающих конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей систематический фрагмент, соответствующий строго определенному Зпитопу антигеннозначи- мой области (428-443 а. к.) др 120 ВЙЧ-1, и экспрессирующей этот фрагмент в виде пептида, слитного ctvl-концом /б-галакто- зидазы, в литературе не имеется. .
Целью изобретения является создание рекомбинантной плазмйдной ДНК, обеспе- чивающей высокий уровень синтеза химерного полипептида, имеющего область гомологии с областью (428-443) белка др 120 ВИЧ-1, являющейся антигеннозначи- мой и обеспечивающей высокий уровень синтеза химерного полипептида, обладающего антигенными свойствами белка др 120
вич-1,. :
Доставленная цель достигается с помощью рекомбинантной плазмиды pGP 120-428, обеспечивающей синтез в клетках
Е. coli полипептида, обладающего антигенными свойствами белка др 120 ВИЧ-1. Плаз- мида pGp 120-428, содержащая химически синтезированный фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка др 120 ВИЧ с координатами 428-443, состоит из следующих элементов:......
большого фрагмента EcoRI-HamHI плазмиды pLZ4 размером (6790 н. п,);
химически синтезированного ЗаиЗА- ЗаиЗА фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность 428-443 белка env ВИЧ-1, HTLV III;
фрагмента EcoRI-Sau3A, размером $8 н.
п. плазмиды рЁМВ 303, содержащего а- амилазный промотор, SD-последОватель- ность и отстоящий от нее на расстоянии 6 нуклеотидных пар инициирующий кодон
ATG.
Плазмида pGp 12Q-428 содержит:
ген устойчивости к аМпициллину в качестве генетического маркера;
имеет молекулярную массу 4,6 МДА (размер 69.55 н. п.);
обеспечивает в клетках Е. col синтез гибридного полипептида, имеющего область гомологии с областью (428-443) белка др 120 ВИЧ-1 и обладающего антигенными свойствами белка др 120 ВИЧ-1. Гибридный
полипептид синтезируется в виде химерной @ -галактозидазы, имеющей на N-конце ан- тигеннозначимый фрагмент, соответствующий участку с 428 по 443 аминокислоту белка др 120.
Сущность изобретения заключается в том, что химически синтезируемый фрагмент ДНК, кодирующий антигеннозначи- мую область белка др 120 env (428-443) ВИЧ-1, соединяют с геном / -галактозидазы в экспрессирующем векторе.
Полученная рекомбинантная плазмида обеспечивает синтез гибридного белка состоящего из полипептида, несущего анти- генную детерминанту белка др 120 env
(428-443) ВИЧ-1, слитного с М-концом {$ -галактозидазы. .
Полученный гибридный белок обладает способностью связывать антитела к ВИЧ-1 сыворотки больных СПИДом в ELISA тестах.
Способ конструирования pGp 120-428 состоит из нескольких последовательных этапов: на первом этапе в исходную плазми- ду pLZ 4 по уникальному BamHI сайту вводят хШически Синтезированный Sau ЗА - Sau
ЗА фрагмент ДНК, содержащий в своем составе сайты для двух эндонуклеаз рестрикции Bgt If и Ham HI. Полученная плазмида названа pZ 41, По двум сайтам EcoRI и Bglll пяазмида pZ 41 встраивают EcoRI-SauSA
фрагмент ДНК из плазмиды рЕМВ 303, содержащий промотор гена а-амилазы, SD- последовательность и следующий за ним на расстоянии 6 н. п. инициирующий ATG ко- дон. Полученная плазмиданазвана.pAZR. Она обеспечивает синтез галактозида- зы с конститутивного промотора Ра гена а амилазы и может быть использована для получения N-концевых гибридных с/3-га- лактозидазой белков, т. к. в начале гена галактозидазы за АТС инициирующим кодоном расположен BamHI уникальный сайт..
На следующем этапе плазмиду pAZR гидролизуют эндонуклеазой рестрикции BamHI и лигируют с химически синтезированным Bglll - Bam HI фрагментом ДНК, кодирующим полипептид, соответствующий области 428-443 др 120 ВИЧ-1.
Полученная плазмида, названная pGp 120-428, обеспечивает в клетках Е. coli синтез гибридного белка, имеющего область гомологии с областью белка др 120 (428- 443) и обладающего антигенными свойствами белка др 120.
Таким образом, впервые получена плаз- мидная ДНК, обеспечивающая в клетках Е. coli синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами др 120 ВИЧ-1 за счет экспрессии искусственного гена, кодирующего антигенно-значимую область белка др 120(428-443), слитую с / -галакто- зидазой.
На чертеже показана схема конструирования плазмиды pGp 120-428.
Обозначения: Ыа -ген / -лактомазы; lacZ-ген/8-галактозидазы: Р«50-регуля- торная область, состоящая из промотора, гомологичного промотору гена а-амилазы из В. subtHis и SD-сайта связывания рибо- сом.
Сущность предлагаемого изобретения раскрывается в следующих примерах.
Пример 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pGp 120-428.
1 мкг ДНК плазмиды pLZ4 расщепляют эндонуклеазной рестрикции Bam HI (10 единиц) в R-буфере, содержащем 10 мМ трис- HCI, рН 7,5, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCla, 1 мМ дитиотрейтола (ДТТ). Реакцию проводят в течение 1 ч при 37 С. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Препарат депротеинизируют с помощью фенольной экстракции, ДНК осаждают эта- нолом и ресуспендируют в ТЕ-буфере, содержащем 10 мМ HCI. рН 8 и 1 мМ ЭДТА.
Препарат индивидуального адапторно- го фрагмента получают при отжиге 60 пико- молей каждого из двух олигонуклеотидов,
длиной 18 нуклеотидов. Полученный адап- торный фрагмент имеет в своем составе сайты для эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Bam HI, содержит выступающие липкие концы для эндонуклеазы рекстрикции Sau ЗА и имеет следующую структуру: Bgl II Bam HI Sau ЗА GATCAGATCTGGATCCGA TCTAGACCTAGGCTCTAG
0Sau ЗА
Лигирование гидролизованной векторной ДНК р124 (0.02 мкг);адапторного фрагмента (0,40 мкг) проводят с помощью ДНК лигазы фага Т4 (4 единицы) в объеме 10 мкл
5 (инкубацию ведут в течение 10ч при 12° С), Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток Е. coll JC 5183.
Трансформанты высевают на агаризо- ван ную среду с ампициллином, перекалыва0 ют на нитроцеллюлозный фильтр и отбирают клоны, гибридизующиеся с олиго- нуклеотидным зондом (в качестве зонда используют меченый Р олигонуклеотид, входящий в состав адапторного фрагмента).
5 Из отобранных клонов выделяют плазмид- ную ДНК, анализируют на наличие сайтов для эндонуклеаз рестрикций: Bgl II. и Ват HI. Структуру подтверждают секвенирова- нием: полученную плазмидную ДНК, содер0 жащую адапторный фрагмент, обозначают pZ 41. 1 мкг ДНКР241 расщепляют эндонуклеазой рестрикции EcoRI в течение часа в R-буфере. После этого добавляют рестрик- тазу Вд II и также инкубируют в течение
5 часа при 37° С. Препарат депротеинизируют с помощью фенольной экстракции, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в ТЕ- буфере.
Фрагмент размером 98 н. п., содержа0 щий промотор а -амилазы, SD-последова- тельность и расположенный от нее на расстоянии 6 нуклеотидных пар, инициирующий кодон, получают на смеси EcoRI - Sau ЗА фрагментов ДНК плазмиды рЕМВ 303.
5 Выделение индивидуального фрагмента проводят путем электрофоретического разделения в 6 %-ом полиакриламиднрм геле с последующей электроэлюцией. Лигирование смеси гидролизованной плазмиды pZ41
0 (0,5 мкг) и фрагмента, кодирующего регуля- торную область из рЕМВ 303 (5 мкг), проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (4 единицы) в объеме 10 мкл (инкубацию ведут в течение 10 ч при 12° С).
5 Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток E.coli JM 103. Трансформанты высевают на агаризованную среду с ампициляином (50 мкг/мл) и J-Gal (0.1 мкг/мл), отбирают клоны, имеющие синюю окраску, выделяют плазмидную ДНК и
Анализируют на содержание клонированного фрагмента.
Плазмидная ДНК, содержащая в своем составе нужный фрагмент, обозначена pAZR. Она обеспечивает синтез / -галактозидазы с конститутивного промотора Ра гена а-амилазы. В начале гена -галактозидазы на расстоянии 15 нуклео- идов от инициирующего кодона ATG нахоится уникальный сайт Ват ИI.
1 мкг pAZR расщепляют эндонуклеазой рестрикции Bam HI (10 единиц) в R-буфере. Реакцию проводят в течение 1 ч при 37° С. Полноту гидролиза анализируют с помощью .электрофореза. Препарат депротеинизиру- ют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в ТЕ-буфере.
Препарат индивидуального фрагмента, кодирующего полипептид, соответствующий области 428-443 белка др 120 ВИЧ-1, получают при отжиге по 50 пикомолей двух комплементарных олигонуклеотидов. длиной 54 нуклеотида.
Полученный фрагмент ограничен выступающими липкими концами: слева - для эн- дрнуклеазы рестрикции Bg l II, справа - для рекстриктазы Bam Hi и имеет следующую структуру:
Bam HI
QATCTGAAGCAGATCATCAACATGTGC CAGCAAGtTCG CAAAGCTATGTACGCG
ACTTCGTCTAGTAGTTGTACACCGTCC TTCAACCGTTTCGATACATGCGCCTAG
Bgl И...
Лигирование смеси гидролизованной flHKpAZR(0,05 мкг) и полученного фрагмента (1 мкг) проводят с помощью ДНК лигззы фага Т4 (4 единицы) в объеме 10 мкл, инкубацию ведут в течение 10 ч. .Полученный смесью плазмид трансформируют Е, coli JM 103. Трансформанты высевают на агаризо- ванную среду с ампициллином (50 мкг/мл), не утратившие синей окраски клоны перекалывают на нитроцеллюлозный фильтр (т. к. при встраивании фрагмента в обратной ори:, ентации в рамке считывания находятся два стоп-кодона, что приводит к остановке считывания гена Д-галактозйдазы и появлению неокрашенных клонов) и отбирают клоны, гибридизующиеся с олигонуклеотидным зондом. В качестве зонда используют один из меченых 3 Р-олигонуклеотидов, входящий в состав лигированного фрагмента.
Из отобранных клонов выделяют плаз- мидную ДНК, анализируют расщеплением эндонуклеазой рестрикции Bsp RI. Структуру подтверждают секвенированием.
Полученную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, соответствующий области белка др 120 с координатами 428-443, обозначают pGp 120-428.
Пример 2. Очистка рекомбинантного
антигеУа.
Клетки Е. coli JM 103, содержащие плаз- ми дурСр 120-428, выращивают на среде LB в присутствии ампйциллина (50 мкг/мл) при 37° С в течение 18 ч. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об./мин в течение 20 мин при 2° С. промывают 0,1 М NaCI и снова осаждают центрифугированием. После определения массы осадка биомассу суспендируют в О.ГМ трис-HCI, рН 7,5, 10
мМ MgCla, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ PMSF, 5 % глицерина, при соотношении: биомасса: буфер: 1 : (10 - 30). Клетки разрушают ультразвуком сериями по 30 с с 30-секундными перерывами при охлаждении в ледяной бане. Суммарное время обработки 5 мин. Суспензию центрифугируют при 10 тыс. об./мин, 2° С в течение 15 минут. К полученному осветленному лизату добавляют 30 %- ый трептомицинсульфат до конечной
концентрации 3 %. После 30-минутной выдержки при 0° С образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Супернатант, содержащий рекомби- нантный антиген/обнаруживаемый по
активности/ -галактозидазы, наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой ДЕ 52, уравновешенную 0,2 М МТМ (буфером, содержащим 0,2 М NaCI, 10 мМ трис-HCi, рН 7,5, 1 мМ МдС)2И 1 мМ ДТТ).
После нанесения колонку промывают 0,2 М МТМ и элюируют сорбированные белки линейным градиентом NaCI (0,2-0,8 М).
Выход гибридного белка определяют по наличию активности /3-галактозыд«зы,
Фракции, содержащие рекомбинантный и- тиген, объединяют, гибридный белок осаждают сульфатом аммония, добавляя его до конечной концентрации 231 мг/мл. Осадок, собранный центрифугированием, раствор ют в 20 мМ трис-HCI рН 7,5, 20 мМ ЭДТА и хроматографируют белок на геле Тоуреаг TSK Gei HW 557. Обнаружение белка производят как описано в случае хроматографии нра ДЭАЭ-целлюлозе. Концентрацию рекомбинантного антигена определяют, учитывая, что величина удельной активности /3-галактозидазы равна 300 тыс. ед. акт./мг. Антигенную активность гибридного белка, полученного после ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, оценивают по результатам иммуноферментного анализа с сыворотками крови человека, унифицированного ВИЧ, Выход гибридного белка, обладающего антигенными свойствами белка
gp 120, составляет 1-2 мг/r клеточной биомассы. : - - - ;
Пример 3. Имуноферментный анализ.
Селективное связывание антител к ре- тровирусу HTLVIII с иммобилизованным рекомбинантным полипептидом, включающим фрагмент белка gp 120 ВИЧ-1. Реком- бинантный полипептид, включающий область (428-443) белка gp 120 ВИЧ-1, подвергали сорбции на полистироловых планшетах производства Nunk (Дания) или Flow (Великобритания) в концентрации 2-10 мкг/мл в 0,06 М бикарбонатного буфера рН 9,6 в течение 16ч при 2-8° С. Далее проводят стандартный тест иммуноферментного анализа с сыворотками донорской крови человека (отрицательные -J) и с сыворотками, содержащими антитела к структурным белкам вируса HTLV III, предварительно верифицированными в тесте иммуноблотинга (положительные +).
Иммуноферментатйвный анализ проводят согласно инструкции по применению тест-системы Рекомбинант-ВИЧ для выявления антител к ВИЧ-1.
1. Выдерживают испытуемые сыворотки в разведении 1 :100 на физиологическом растворе, забуференном фосфатами, рН 7,4, с добавлением детергента ТВИН-80 до конечной концентрации 0,5 % (ФСБ-Т) в лунках планшета с сорбированным полипептидом, включающим фрагмент белка gp 120 ВИЧ-1.
Инкубацию проводят при 37° С в течение 60 мин.
Несвязавшиеся компоненты сывороток отмывают Зраза ФСБ-Т.
2. Выдерживают отмытые планшеты с коньюгатом (белок А золотистого стафилококка - пероксидаза хрена) в рабочем разведении. Инкубацию проводят при 37° С в течение 60 мин, отмывают 3 раза.
3. Инкубация с ферментативным субстратом, представляющим собой 5 М растворортофенилендйамина в цитратно-фосфатном буфере, рН 6 с добавлением 0,025 % перекиси водорода. Инкубацию с субстратом проводят 30 мин при комнатной температуре в темноте. Для остановки реакции к пробе (100 мкл) прибавляют 50 мкл 2 М H2S04, стабилизирующей хромогенный продукт реакции.
4. Для количественной оценки результатов планшеты с субстратом после остановки реакции помещают в автоматический фотометр типа Мультискан для измерения поглощения при длине волны 492 нм. Для вынесения заключения о специфическом связывании антител к ретррвирусу HTLV III с рекомбинантным пептидом оценены следующие показатели:
интенсивность связывания иммуногло- булинов из положительной сыворотки с ре- комбинантнымиполипептидом, включающим область gp 120 (А+492);
интенсивность связывания иммуноглобулинов из коммерческого диагностического набора в рекомбинантным пептидом
(А 492).
В 20 экспериментах в качестве подложки были использованы четыре образца рекомбинантного полипептида. Среднее значение величин связывания иммуногло- булинов из положительной сыворотки с рекомбинантным полипептидом (А+492) составило 0,499, среднее значение величин
связывания иммуноглобулинов из отрицательной сыворотки () 0,266 математическая обработка по методу вычисления критерия Стыодента показала, что отличия значений А+492 и достоверны (Р 0,999).
Предлагаемое изобретение позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 10 мг гибридного белка, имеющего область гомологии с белком gp 120 (428-443)ВИЧ-1 и обладающего антигенными свойствами белка
gp 120 ВИЧ-1. При этом синтезируемый гибридный белок представляет собой полипептид, состоящий из 16 аминокислот, соответствующих; области белка gp 120 (428-443), фланкированный слева 8 аминокислотами, кодируемыми регуляторным фрагментом и адапторной последовательностью, и справа 4 аминокислотами, кодируемыми линкерной областью, и 1033 аминокислоты белка / -галактозидазы.
Таким образом, в изобретении впервые получен гибридный полипептид, обладающий антигенными свойствами белка gp 120 ВИЧ-1 за счет экспрессии химически синтезированного фрагмента ДНК, гомологичного антигеннозначимой области белка gp 120 с координатами 428-443, слитого с геном /3-галактозидазы,
Формула изобретения Рекомбинантная плазмидная ДНК pGp 120-428, кодирующая гибридный белок с
антигенными свойствами белка gp 120 ВИЧ- 1, имеющая размер 6955 н. п. и состоящая из:
EcoRI - Bam HI фрагмента ДНК вектора pLZ4, размером 6790 н. п., Sau ЗА - Sau ЗА синтетического фрагмента ДНК. размером 54 н.п.. кодирующего область белка др 120 env (428-443) ВИЧ-1; Заи ЗА - EcoRI фрагмента ДНК из плазмйды РЕМВ 303, размером 98 н. п., кодирующего промотор, гомологичный промотору а -амилазы из
tcoti
BamHI
Bacillus subtilis, SD-лоследоеательность. АТЈ-инициирующий кодон, генетические маркеры Арг-ген устойчивости к ампицил- лину; уникальные сайты рестрикции EcoRI. SalG1, расположенный вправо от EcoRI на расстоянии 3248 Н. п., Pstl, расположенный влево от EcoRI на расстоянии 752н. п.
