Способ выделения пектолитических ферментов Советский патент 1992 года по МПК C12N9/00 C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения пектолитических )ментов.

И-звестен способ получения пектолитических ферментных препаратов из растворов согласно которому проводят подкисленйе раствора до рН 2.0-3,0, смешивание его с органическим растворителем до рН смеси 3.5-4,0 для преимущественного осаждения пектинэстеразы. при этом в жидкую фазу вводят стабилизатор и затем смешивают ее с органическим растворителем до достижения рН смеси 4. и получейный осадок, преимущественно содержащий полигалактуроназу. отделяют от жидкости.

Известен также способ выделения ферментов, в том числе пектолитических из

жидких растворов, включающий введение в раствор сульфата аммония, вспенивание раствора путем пропуска через него воздуха, сбора и концентрирования пены.

Недостатком указанных способов является неполное выделение целевых ферментов.(

Цель изобретения - увеличение выхода пектолитических ферментов с одновременным выделением протеолитических ферментов.

Поставленная цель достигается тем, что введение сульфата аммония, вспенивание и отбор пены ведут многократно, при этом сульфат аммония добавляют с шагом 0,1 до достижения степени насыщения, величину рН раствора доводят до 8,5 и от 8.5 до 2,5 с

агом 0,5 и выделяют из раствора протеоитические ферменты, после чего к оставшемуся раствору добавляют сульфат аммония шагом 0,1 до достижения степени насыщения и изменяют величину рН раствора до ,5, а затем снижают до 2,5 с шагом 0,5 и выделяют пектолитические ферменты, при этом вспенивание и отбор пены проводят после каждого изменения показателя насыщения и величины рН.

Предлагаемый способ осуществляется

следующим образом.

В исходный раствор вводят сульфат аммония до степени насыщения 0,1, рН расвора доводят до 2,5, вспенивают путем подачи воздуха через раствор и отбирают пену. После отбора пены рН раствора доводят до 3,0. Раствор вспенивакгт. Пену отбирают. Процесс вспенивания и отбор пены осуществляют многократно при изменении рН раствора до 8,5 с шагом 0,5. Затем добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,2. Раствор вспенивают, пену отбирают. Далее процесс вспенивания и отбор пены осуществляют многократно при изменении рН до 2,5 с шагом 0,5. Сульфат аммония добавляют до степени насыщения 0,3. Раствор вспенивают, пену отбирают. Процесс вспенивания и отбор пены осуществляют многократно при изменении рН до 8,5 с шагом 0,5. Затем добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,4. Расвор вспенивают, пену отбирают. Процесс вспенивания и отбор проб осуществляют многократно при изменении рН до 2,5 с шагом 0,5 и добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,5. Раствор вспенивают. Пену отбирают. Процесс вспенивания и отбор проб осуществляют многократно при изменении рН до 8,5 с шагом0,5. Затем опять добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,6. Раствор вспенивают, пену отбирают и процесс вспенивания и отбор проб повторяют многократно при снижении

рН до 2,5 с шагом 0,5. Отобранные фракции пены объединяют в одну ииспользуют для получения протеолитическ.их ферментов, добавляют сульфат аммония до степени насыщения OJ. Раствор вспенивают, пену отбирают, доводят рН до 3,0 и снова вспенивают раствор и отбирают пену. Процесс вспенивания и отбор пены повторяют многократно, изменяя рН до 5,5 с шагом 0,5. После отбора пены при значении рН 5,5 снова добавляют сульфат.аммония до степени насыщения 0,8, раствор вспенивают, пену отбирают. Затем снижают рН до 5,0, раствор вспенивают, пену отбирают. Процесс вспенивания и отбор пены осуществляют многократно при изменении рН.до 2,5 с

шагом 0,5. Затем добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,9, раствор вспенивают, пену отбирают. Процесс вспенивания и отбор проб осуществляют многократно при изменении рН до5,5 с шагом 0,5. После этого добавляют сульфат аммония до степени насыщения 1,0, раствор вспенивают, пену отбирают. Процесс вспенивания и отбор пены осуществляют многократно при

0 изменении рН до 2,5 с шагом 0,5. Отобранные фракции пены при степени насыщения 0,7-1,0 объединяют в одну для получения пектолитйческих ферментов.

Целесообразно процесс выделения

5 протеолитических ферментов с целью освобождения пектолитйческих производить в интервале рН от 2,5 до 8,5, так как при этом происходит выделение множественных форм протеолитических ферментов, имеющих различные изоэлектрические точки, а процесс выделения пектолитйческих ферментов при рН 2,5-5,5, так как изоэлектрические точки различных форм пектолитйческих ферментов находятся в

5 этом пределе.

Выделение пектолитйческих ферментов в интервале рН ДО8,5 существенно не увеличивает выхода.ферментов.

Выделение ферментов следует прово0 Дитьпри константе насыщения от 0,1 до 1,0, так как при константе насыщения от 0,1 до 0,6 выделяются различные формы протеолитических ферментов, а при константе насыщения от 0,7 до 1,0 происходит выделение

5 различных форм пектолитйческих ферментов, имеющих молекулярные массы меньше, чем протеолитические.

При проведении процесса выделения при константах насыщения от 0,1 до 0,6

0 происходит предварительное выделение, в основном, высокомолекулярных протеолитических ферментов, которые мешают выделению пектолитйческих ферментов. При константе насыщения сульфата аммония

5 0,7-1,0 выделяются пектолитические ферменты, освобожденные от протеолитических.

Изменение рН при каждом значении степени насыщения сульфата аммония

0 обусловлено тем, что существуют множественные формы выделяемых протеолитических и пектолитйческих ферментов, имеющих различные изоэлектрические точки в интервале рН от 2.5 до 8,5.

5 П р и м ё р 1 (известный). Выделение пектолитйческих ферментов проводят, из 100 л концентрата глубинной культуры Aspergillus foctidus М-45. рН концентрата доводят до 3,0 ортофосфорной кислотой. Затем в концентрат добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,8. Смесь активно перемешивают, После полного растворения сульфата аммония смесь барботируют воздухом в количестве 0,1 объема наобьем смеси в 1 мин. Образующуюся пену собирают и гасят. Перемешивание и барбртаж заканчивают с прекращением пенообразования. Образующаяся жидкость представляет собой высокоактивный очищенный концентрат пектолитических ферментов, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки. С 1 м культуральной жид кости после вакуум-концентрирования получают 100 л концентрата с активностью 40 ед/мл. а после осаждения аммония, сбора и гашения пены - 2,2 я раствора выделенных пектолитических ферментов с активностью 1778 ед/м/i. Суммарная активность пактолитических ферментов 3,91-10 ед.

П р и м е р 2. Выделение пектолитических ферментов проводят из 100 л концентрата глубинной культуры AspergitluS foetidus М-45 ед/мл следующиг образов. В. концентрат добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,1, доводят рН до 2,5, вспенивают, отбирают пену, затем доводят рН до 3,0, вспенивают, отбирают пену, да-; лее процесс вспенивания и отбор проб повторяют многократно при изменении рН раствора до 8,5 с шагом 0,5, затем в раств ор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,2, вспенивают, отбирают пену, доводят рН до 8,0, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при константе насыщения сульфата аммония 0,2 повторяют многократно прй.изменении рН до 2,5 с шагом 0,5, затем в раство р добавл я ют сул ьфат аммония до Степени насыщения 0,3, вспенивают, отбирают пену, доводят рН до 3,0, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспениванмя и отбор пены при константе насыщения 0,3 повторяют многократно при изменении рН до 8,5 с шагом 0,5, затем в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,4, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при константе насыщену1я 0,4 повторяют многократно при изменении рН до 2,5 с шагом 0,5, затем в раствор добавляют сульфат аммо ния до степени насыщения 0,5, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания; и отбор пены при константе насыщения 0,5 повторяют многократно при изменении рН до 8,5 с шагом 0,5, затем в раствор добайляг ют сульфат аммония до степени насыщени 0,6, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при константе насыщения 0,6 повторяют многократно при изменении рН до 2,5 с шагом 0,5. Полученные фракции пены объединяют и гасят механическим путем. Образующаяся жидкость представляет собой концентрат 5 протеолитических ферментов с активностью 53 ед/мл. Далее в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,7, вспенивают, отбирают пену, затем доводят рН до 3,0, вспенивают, отбирают пену, затем процесс вспенивания и отбор пены осуществляют 5 раз при изменении рН до 5,5 с щагом 0,5, далее в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,8, вспенивают, отбирают пену, затем доводят рН до 5,0, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при степени насыщения 0,8 производят 5 раз с изменением рН до 2,5 с шагом 0,5, затем в раствор добавляют сульфат

0 аммония до степени насыщения 0,9, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены осуществляют 5 раз с изменением рН до 5,5 с шагом 0,5, после этого в раствор добавляют сульфат

5 аммония до степени насыщения 1,0, вспенивают, отбирают пену, доводят рН до 5,0, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и пены осуществляют 5 раз с изменением рН до 2,5 с щагом 0,5.

0 Вспенивание раствора проводят подачей через него воздуха в количестве 0,1 объема на объем смеси в минуту. Отобраннук пену при константах насыщения сульфата аммония 0,7-1,0 объединяют, гасят механическим путем. Образующаяся после гашения пены жидкость представляет собой концентрат пектолитических ферментов, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки.

0 После пеногашения гюлучают 3л раствора пектолитических ферментов с активностью 1903 ед/мл. Суммарная активность пектолитических ферментов составила 5,.

5 Таким образом, выход пектолитических ферментов по предлагаемому способу на 46% выше, чем по прототипу.

П р и м е р 3, Процесс ведут по примеру 0 2, но выделение пектолитических ферментов проводят в интервале рН от 2,5 до 8,5.

Суммарная активность пектолитических ферментов составила 5,70-10 ед. .

Приме р 4. Процесс ведут по примеру 5 2, но выделение пектолитических ферментов проводят в интервале рН 2,0-10,0.

Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов составила 5,73-10 ед.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении пектолитических ферментов. Цель изобретения - увеличение выхода пектолитических ферментов с одновременным выделением .протеолитических ферментов. Изобретение заключается в том, что добавление сульфата аммония в раствор, вспенивание и отбор пены осуществляют многократно, при этом для выделения протеолитических ферментов вспенивание и отбор пены осуществляют при изменении степени насыщения с 0,1 до 0.6'с шагом 0.1 и изменении рН раствора с 2.5 до 8.5 или с 8,5 до 2.5 с шагом 0.5^ после чего осуществляют выделение гтектолитинеских ферментов многократным вспениванием и отбором пены при изменении степени насыщения с 0.6 до 1,0 с шагом 0.1 и изменении рН раствора с 2.5 до 5,5 или с 5.5 до 2.5 с шагом 0.5. Выход пектолитических ферментов увеличен на 46%. 1 табл.^