Способ выделения витамина В @ Советский патент 1992 года по МПК C12P19/42 C07H23/00 

Изобретение относится к микробиологии, биохимии и физхимии, в частности к способу выделения витамина Bi2 из клеток пропионовокислых бактерий - промышленных продуцентов витамина ВпИзвестны способы получения витамина Bi2, заключающиеся: в фотохимическом преобразовании кофермента Bt2 или окси- кобаламина и их злкильных производных в витамин В12: в аэробной ферментации арт- робактерий с последующим выделением из биомассы в результате гидролиза и феноль- но-хлороформенной экстракции витамина В12; в выделении и очистке витамина Bi2 на ионообменной смоле, содержащей сополимер дивинилбензола и стирола; в кислотном гидролизе бактериальной массы с последующим выделением витамина В12 в результате фенольно-хлороформенной экстракции.

Недостатки приведенных способов выделения витамина Bi2 заключаются в дороговизне оборудования и реактивов, применяемых для очистки, дороговизне многокомпонентных питательных сред для выращивания микроорганизмов, необходимости энергетических затрат для проведения гидролиза.

Наиболее близким по технической сущности является способ выделения витамина Bi2 из биологического материала, заключающийся в том. что клетки микроорганизмов, содержащие кобаламины,отделяют от культуральной жидкости путем центрифугирования, заливают 5-6 объемами воды и в

Ч

&А

О

ы

течение 5-10 мин автоклавируют при рН 4-5 в присутствии 4 мг% KCN. После центрифугирования супернатант подщелачивают до рН 8-9, к нему добавляют 4 мг% KCN и выдерживают в темноте в течение 1 ч для перевода кобаламина в дициамид- ную форму. Их извлекают путем многократной экстракции небольшими порциями фенол-хлороформенной смеси (1:1). Из смеси кобаламины переводят в воду при добав- лении 1,5 объема хлороформа и 0,75 объема н-бутанола. Следы хлороформа и бутанола удаляют посредством обработки содержимого этиловым эфиром. Концентрацию ко- баламинов в водном растворе определяют спектрофотометричееки.

Недостатком известного способа является громоздкость, длительность самого технологического процесса выделения витамина В12, требующего использования до- полнительного оборудования и затрат электроэнергии (эвтоклавирование), многократность экстракции, ведущая к продолжительному процессу получения продукта. Кроме того, недостатком способа является низкий выход витамина Вг2 в связи с тем, что зкстракция фенол-хлороформенной смесью не ведет к полному извлечению витамина Bi2. Невысокий выход витамина Bi2 получается в результате количественных его потерь при термической денатурации.

Цель изобретения - увеличение выхода витамина и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, включающему культиви- рованйе пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости от биомассы, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, перед экстрагированием разрушенные клетки обрабатывают 0,5-3%-ным раствором анионного детергента додецил- сульфата натрия в щелочной среде при рН 9 10 на протяжении 0,5 ч.

Кроме того, разрушение клеток осуществляется путем замораживания их при температуре (-4)-(-12}°С и выдержкой в течение 1 ч с последующим оттаиванием..

Предлагаемый способ отличается от известного совокупностью признаков: обработка 0,5-3%-ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия при рН 9-1.0 в течение 0,5 ч; для разрушения клеток используют процесс заморажиаания при температуре(-4}-(-12)0С и выдержку в течет ние 1 ч с последующим оттаиванием,

Широкое применение в микробиологических экспериментах, связанных с извлечением и солюбилизацией гидрофобных и встроенных в структуру бактериальных клеток белков, тейхоевых кислот, липидов и ли- пополисахаридов нашли детергенты. В основе солюбилизирующего действия детергентов лежит их амфифильная природа, позволяющая им взаимодействовать и с гидрофобными и гидрофильными участками белков, либо других соединений, обладающих амфипатическими свойствами. В ряде случаев поверхностно-активные вещества выступают в качестве специфических экстрагирующих реагентов.

Известно, что обработка детергентами вызывает диспергирование клеточных стенок, нарушение целостности наружных слоев клетки, увеличение проницаемости, разрыхление и обезвоживание клеточной стенки вплоть до полного или частичного растворения и выхода внутриклеточного содержимого в среду. Но ни один из используемых детергентов не образует комплексного соединения с кобаламином.

Однако неизвестно, что именно DDCNa вызывает специфическую солюбилизацию витамина 612 из клеток бактерий.

Итак, предложено использовать в качестве детергента додецилсульфат натрия, вызывая специфическую солюбилизацию витамина 812 из клеток бактерий.

В основе обнаруженного явления может лежать специфичность взаимодействия отрицательно заряженого неорганического фрагмента молекулы детергента с положительно заряженным атомом кобальта в молекуле витамина Bt2, что не исключает и других вероятных механизмов. Пропионо- вокислые бактерии синтезируют кроме витамина Bt2 такие соединения, как флавины, менахиноны, цитохромы, порфирины и т.д. Однако после обработки клеток DDCNa в щелочной среде из бактерии выходит витамин В12. а не какое-либо из перечисленных соединений. Даже в специальной литературе, посвященной способам разрушения бактерий, нет сведений о применении DDCNa для дезинтеграции клеток при щелочных рН, как наиболее эффективном методическом подходе.

При щелочных значениях рН (9 или 10) изменяется поверхностный заряд клеток бактерий, что позволяет алкильным частям молекул DDCNa взаимодействовать с гидрофобными участками клеточных стенок бактерий и приводит к их дезинтеграции. В результате взаимодействия щелочного раствора DDCNa с суспензией бактериальных клеток при перемешивании окончательное значение величины рН становится нейтральным, что в свою очередь обуславливает стабильность выхода витамина Bi2. При взаимодействии сильно щелочных детергентов с витамином 812 образуется соединение кобаламиновой природы, снижающее рН до нейтрального, которое в дальнейшем не приводит к разрушению витамина Bi2. Существующие способы выделения витамина 812 проводятся в средах с слабокислым и нейтральным значением рН, что приводит к неполному извлечению витамина 812 из клеток и низкому его выходу.

Снижение рН раствора до 9,0 либо увеличение свыше 10,0 снижает выход витамина В12 из клеток за счет физико-химических изменений, происходящих с молекулами детергента. Более низкий выход витамина Bi2 наблюдается и при снижении концентрации DDCNa менее 0,5% или увеличении ее свыше 3% за счет снижения числа мицелл детергента, способных специфически взаимодействовать с молекулами кобалами- нов.

Выбор рН и концентрации детергента подтверждаются данными, приведенными в табл. 1.

Замораживание - процесс известный, но в предлагаемом способе он ускоряет разрушение клеток. В этих температурных границах (-4)-(-12)°С происходит кристаллизация свободной воды в клетке. Ослабевают межмолекулярные связи в клеточной стенке, облегчается доступ DDCNa к внутреннему содержимому клетки, а именно к веществам кобаламиновой природы.

Обработка 0,5-3%-ным раствором DOCNa, который взаимодействует с кобала- минами. ведет к образованию соединений, легко экстрагируемых органическими растворителями. Такое соединение с другими детергентами неионной (тритон Х-100, 114, 305, твин 20,40, 60, 65, 80), катионной (ката- мин АВ, цетилтриметиламмонийбромид, цетилтриметилпиридинийхлорид), анионный (холат и дезоксихолат натрия) природы-, обладающих общеизвестным свойством - дезинтегрировать микроорганизмы, только DDCNa оказался способным специфически извлекать витамин Bi2 из бактериальных клеток (табл. 1).

Пример 1. Культуру пропионовокис- лых бактерий (штамм Propionibacterfum shermanii МУ-512) выращивают на синтетической среде. На 3-е сутки культивирования вносят 5,6-диметилбензамидозол (5,5- ДМБ). На 5-е сутки культивирования клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин, затем промывают физраствором и замораживают

при -4°С в течение 1 ч. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5%-ного раствора DDCNa при рН 10,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при 5 комнатной температуре, после чего центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 2 мл 0,5%-ного раствора DDCNa при рН 10,0, центрифугируют в том же режиме, а супернатанты сливают. В супернатант 10 добавляют 2 мг% KCN, встряхивают и выдерживают в темноте 20 мин. Витамин Bi2 извлекают путем многократной экстракции небольшими порциями фенол-хлорофор- менной смеси (1:1). Из смеси витамин пере5 водят в воду при добавлении 1,5 объема хлороформа и 0,75 объема н-бутанола. Сле- дьГхлороформа и бутанола удаляют посредством обработки содержимого этиловым эфиром. Концентрацию витамина 812 опре0 деляют спектрофотометрически при длине волны 361 нм.

Параллельно проводят выделение витамина В12 по известному способу с тем же количеством бактериальных клеток. Содер5 жание витамина 812 в экстрактах из клеток пропионовокислых бактерий: по известному способу - 480 ± 0,2 мкг/г сухого веса клеток; предлагаемым способом - 760 ± 0,1 мкг/г сухого веса клеток. Выход

0 витамина 812 при выделении предлагаемым способом выше на 57-58%.

П р и м е р 2. Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток,про- мывание физраствором и замораживание

5 их проводят по примеру 1. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 3%-ного DDCNa при рН 9,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центри0 фугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 3%-ным раствором DDCNa при рН 9,0, центрифугируют, добавляют 2 мг% KCN, встряхивают, выдерживают в темноте 30 мин. Витамин Bi2 извлекают путем мно5 гократной экстракции небольшими порциями фенол-хлороформенной смеси (1:1), затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина 110% по сравнению с известным способом,

0 П р и м е р 3. Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание их проводят по примеру 1. КЗ г замороженных клеток добавляют 8 мл 4%-ного DDCNa

5 при рН 11;0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 4%-ным DDCNa при рН 11, центрифугируют, добавляют 2 мг% KCN, встряхивают в темноте 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина В12 составляет 37,5% по сравнению с известным способом.

. П р и м е р 4. Выращивание пропионо- вокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание их проводят по примеру 1. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,3%-ного DDCNa при рН 7,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 0,3%-ным раствором DDCNa при рН 7,0, добавляют 2 мг% KCN, встряхивают и выдерживают в темноте 30 мин, Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина 64,6% по сравнению с известным способом.

П р и м е р 5, Выращивание пропионо- вокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором, и замораживание проводят по примеру 1. К 3 г замо- роженных клеток добавляют 8 мл 0.507,-ного.тритона Х-100 при рН 10,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, добавляют 2 мг% KCN, встряхивают, выдерживают в темноте 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина 812 не наблюдают.

П р и м е р 6. Выращивание пропионо- вокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру 1. КЗ.г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5%-ного цетилтри- метиламмонийбромида (ЦТАБ) при рН 10,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 0,5%-ным ЦТАБ при рН 10,0, центрифугируют, добавляют 2 мг% KCN, встряхивают, выдерживают в комнате 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина Bi2 не наблюдают.

. Пример. Выращивание пропионо- вокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру Т. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5%-ного холата натрия при рН 20,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 0,5%-ным холатом натрия при рН 10,0, центрифугируют, добавляют 2 мг% KCN. встряхивают, выдерживают е

темноте 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина Bt2 не наблюдают.

Для сравнения данные, полученные под влиянием рН и концентрации DDCNa на выход витамина Bi2 из клеток Propionibacterium freudenrelchli subs, shermanil, сведены в табл. 1.

Во всех приведенных примерах исполь- зуют известную синтетическую среду состава, г/л:

(NH4)2S046

К2НР047

КН2Р043

NaCI0,5

MgSQ4-7H200,1

Глюкоза40

Цитрат На0,5

CoCl2 2H2O5мг%

РеС1з-6Н201мг%

Растворы витаминов и

микроэлементовПо 1 мл/л

Дистиллированная вода До 1,0л.

Данные о специфической солюбилизи- рующей активности DDCNa характерны не только для мутантного штамма МУ-512, отличающегося высоким уровнем кобэлами- ногенеза, но и других штаммов (МУ-3, исходного природного штамма Познанско- го); табл. 2..

Конкретные значения концентрации DDCNa и величины рН обусловлены физико- химическим состоянием самого вещества, так как его солюбилизационные свойства обнаруживаются только при определенных значениях концентрации и рН.

В табл. 3 приведена зависимость содержания витамина Bi2 от типа детергента (все детергенты используются в концентрации 0,5% при рН 10,0).

Как видно из приведенных в табл. 3 данных, предлагаемый способ выделения вита- мина Bi2 существенно отличается от известных и обладает явными преимущест- вами; отсутствие процесса гидролиза сокращает время получения витамина, а отсутствие нагрева уменьшает затраты энергии.

50

Формула изобретения

1. Способ выделения витамина Bi2, включающий культивирование пропионово- кислых бактерий, отделение культуральной жидкости, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию Фенол-хлорофор- мениой смесью и получение готового продукта, отличающийся тем. что, с целью увеличения выхода витамина и упрощения способа, перед экстрагированием клетки обрабатывают 0.5-3%-ным раствором анионного детергента додецилсульфа- та натрия в щелочной среде при рН 9-10 в течение 30 мин.

2. Способ по п. 1, отличающ и и с я тем, что обработку биомассы осуществляют путем замораживания клеток при температуре (-4)-(-12)°С и выдерживания в течение 1 ч с последующим оттаиванием.

Изобретение относится к микробиологии, биохимии и физхимии, в частности к способу выделения витамина 812 из клеток пропионовокислых бактерий. Цель изобретения - увеличение выхода витамина и упрощение способа. Способ выделения витамина 812 включает культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, при этом перед экстрагированием клетки обрабатывают 0,5-3%-ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН 9-10 в течение 30 мин. Обработку биомассы осуществляют путем замораживания клеток при температуре (-4)-(-12°С)и выдержки в течение 1 ч с последующим оттаиванием. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

Тип детергента

Неионные:

тритон х-100 (пример 5

тритон х-114

тритон х-305 твины 20. 40, 60, 65, 80 Катионные:

ЦТПХ, катамин АВ

ЦТАБ (пример 6) Анионные:

холат натрия (пример

дезоксихолат натрия

DDCNa

Таблица 1

Таблица 2

10

Таблица 3

Содержание витамина В 12,мкг/г сухого веса клеток

760 ±0,1