Способ определения функциональной зрелости иммунной системы телят Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

получение суспензии МПК, культивирование клеток, подсчет интенсивности синтеза ДНК, оценка результатов.

Получение суспензии МПК.

Суспензию МПК получают путем одно ступенчатого центрифугирования гепзри- низированной (40 ед/мл) крови в градиенте плотности фиколл-верографин (плотность градиента 1,077, приготовленного на рас- таоре Хеыкса без добавления индикатора). Температуря градиента -i8-10°C. Само центрифугирование желательно проводить в рефрижераторной центрифуге при 1500 об/мин г, течение 30 мин. Полученные моно- нуклсары отмывают от градиента дважды охлажденной средой 199. Жизнеспособность клеток оценивается трипзповым синим и должна составлять 90-95%. Клеточную взвесь разбавляют культурзль- ной средой, доводя концентрацию клеток до 1-5 х 106 кл/мл.

Культивирование клеток,

Длл культивирования МПК используется г /та елкная среда следующего состава: среда с 1000 мг/л бикарбоната натрия 100 ед/мл пеницилпина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мкг/мл глутамина, 5% эмбриональной телячьей сыворотки.

После разбавления клеток питательной средой по 20 мкл клеточной суспензии помещают в плексиглассовые планшеты с пупками и инкубируют в течение 72 ч при 37°С.

Подсчет интенсивное т, синтеза ДНК.

За ч до окончания 72-часовой инкубации культур МПК о культурапьную среду добавляют Н-тимидин в молярной активности 15 мКи/мл, После окончания инкубации клеток, суспензии переносятся на мембранные фильтры, промывают холодной ТХУ, фиксируют в этаноле и освобохда - готся от остатков воды в смеси этанол-эфир Фильтры помещают в радиационные впалы и заливают 10 мл сцингилляционной жидкости. Радиоактивность киспотонераст- воримой фракции подсчитывают на сцин- тилляционном бегаспектрометре.

Оценка результатов.

Результат учитывают по включению Н-тимидина в МПК, выражающийся в имп./мин па 10 клеток.

Как покззап ретроспективный анализ заболеваемость животных после рождения зависит от спонтанного синтеза ДНК в МПК. Дачные представпены в табл. 1.

Доказательством того, что высокий или низкий спонтанный синтез ДНК в МПК новорожденных телят является признаком недостаточно созревшей иммунной системы

являются данные о времени становления друшх показателей иммунной системы, приведенных R табл, 2.

Пример 1. У новорожденно о те пенка

в стерильную пробирку с гепарином берут 5 мл крови.

До проведения исследований (до 5-8 ч) пробирка с кровью хранится в холодильнике. Центрифугированием в одноступенчатом градиенте фикоплверографин получают суспензию МПК, отмывают клетки в холодной среде 199.

Оценивается жизнеспособность клеток

трипановым синим. 5x10 клеток добавляют в плсншегп с обогащенной питательной средой, (летки инкубирую в течение 72 ч при 37°С. За 4 ч до окончания инкубации добавляют П-тпмидин. После окончания

инкубации клетки осаждают на мембранные фильтры, промывают и подсчитывают радиоактивность кислотоисрастворимой фракции.

Если показатели синтеза ДНК в МПК

1GOQ- 800 пмп./мин, теленок родился с им- мун юй системой, соответствующей данному периоду его развития.

Егли показатели выше или (что хуже) ниже, то иммунная система животного фун

кципнально незрела и теленок подвержен инфекциям, его относят к группе риска,

Способ позволяет проводить раннюю диффоронциаци ij животных по степени зрелое и иммунной системы, что дает возможность целенаправленно проводить профилактические мероприятия, выявить группы риска и прогнозировать состояние здоровья поголовья

Число ложно-положительных определений 9%; ложно отрицательных 14%,

Формула изобретения

Способ определения функциональной зрелости иммунной cwc i емы телят путем исследования образца ткани с последующим выявлением оценочного показателя, о т л и- ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения физиологичное™ способа за счет прижиз- ненного олределения функциональной зрелости иммунном с.истемы, в качестве образца ткани исследуют фракцию лимфоцитов периферической крови, при этом проводят инкубацию лимфоцитов в течение 72 ч в присутствии Н-тимидина с молярной активностью 15 МКи/мл, который добавляют к клеткам за 4 ч до окончания инкубации, затем осаждают на мембранные фильтры, обрабатывают трихлоруксусной кислотой, измеряю радиактивность кислотонерас воримой фракции и при ее значении 1600- 2820 ммп/мин на 10 клеток определяют

функциональную зрелость иммунной системы телят,

Таблица 1

Таблица 2