Способ выделения 5 @ -нуклеотидазы из яда кобры Советский патент 1990 года по МПК C12N9/22 

Ичобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению чистой 5 -нуклеотидаэы яда кобры - специфического фермента, катализирующего гидролиз 5 -рибонуклео- тида до рибонуклеозида и ортофосфата (высокая специфичность 5 -нуклеотида- ды делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот).

Цель изобретения - упрощение способа и повышение чистоты целевого продукта за счет разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоно- эстеразЫо

Способ включает растворение яда кобры в буферном растворе с последующим центрифугированием при 5000 об/мин и хроматографирование раствора яда на гептил-агарозе, причем растворение яда и хроматографию осуществляют с использованием в качестве буфера 0,35- 0,45 М раствора сернокислого аммония (рН 6,5-7,5) и 5 -нуклеотидаза элюируется после основного количества белка, полученный раствор 5 -нуклеотидазы концентрируют при упьтрафильтрации.

При концентрации сернокислого аммония в элюенте ниже 0,35 М часть

сл

-Ј,

4

00

5 -нуклеотидазы проходит колонку геп- тил-агарозы, и выход резко понижается. При концентрации сернокислого аммония выше 0,45 начинается адсорбция фосфодиэстеразы на гептил-агарозе, как и при рНвыше 7,5, При рН ниже 6,5,5 -нуклеотидаза инактивируется.

Использование сернокислого аммония В качестве буфера на стадии растворения яда обеспечивает создание подходящей среды для последующего разделения на гептил-агарозе. Концентрация раствора сернокислого аммония 0,35- ),45 М является самой высокой концентрацией, которая позволяет исключить адсорбцию остальных нуклеаз (неспецифической фосфомоноэстеразы и фосфоэстеразы), а также является практически самой низкой концентрацией, (которая обеспечивает полное связывание 5 -нуклеотидазы на гептил-агарозе и ее элюирование после основного количества белка. Самые лучшие результаты разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы реализуются в интервале рН 6,5-7-,5„ Из алкил-агароз оптимальным сорбентом является гептил-агароза. На гексил-агарозе 5 -нуклеотидаза связывается слишком слабо, что не обеспечивает полноту разделения от компонентов яда и высокий выход, а на октил- агарозе частично связывается фосфоди- зстераза, и градиентное элюирование не гарантирует полное разделение 5 - нуклеотизады от фосфодиэстеразы, Хро- матография на гептил-агарозе обеспечивает практически полное разделение 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы и фосфодиэстеразы (см,чертеж),

Способ заключается в следующем. Яд кобры растворяют в растворе 0,35-0,45 М сернокислого аммония (рН 6,5 - 7,5), центрифугируют при 5000 об/мин при 4°С в течение 30 мин осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии.

II р и м е р 2. К0,5г яда кобры добавляют 4 мл раствора 0,40 М сернокислого аммония (рН 7,0), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4°С, Растворенный яд центрифугиру I ют при 5000 об/мин при 4°С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматогХроматографию проводят на гептил-ага- уравновеше 0 „4 „ аст. розе в растворе 0,35-0,45 М(сернокис- эи

лого аммония (рН 6,5-7,5).5 -Нуклеотидаза связывается на колонке гептил- агарозы и элюируется после основного белка 0,35-0,45 М раствором сернокислого аммония(рН 6,5-7,5). Полученный фермент концентрируется при помощи ультрасЬильтрации, Характеристика препарата: выход 90%, степень очисткивором сернокислого-аммония ГрН 7,0) колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1%2,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,440 М раство- 55 ром сернокислого аммония (рН 7,0) со скоростью 26 мл/ч, отбирают фракций по 13 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорд-П. Неспецифическая фосфов 25 зы и

раз„ Содержание фосфодиэстера0

5

0

5

0

5

0

45

1 . К, 0,5 г яда кобры раствора 0,35 М сернонеспецифической и ЛосЛомоноэсте- разы ниже 0,05% от активности 5 -нук- леотидазы.

Пример добавляют 4 мл

кислого аммония (рН 6,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С, Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную 0,35 М раствором сернокислого аммония (рН 6,5), колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,35 М раствором сернокислого аммония (рН 6,5.) со скоростью 26 мл/ч, отбирают фракции по 13 мм. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорд-11 0 Неспецифическая фосфомоноэстераза, фосфодиэстераза , рибонуклеаза и основное количество белка в данных условиях проходят колонку, а 5 -нуклеотидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных услови- ях, связывается на гептил-агарозе и элюируется раствором 0,35 М сернокислого аммония при рЫ 6,5. Фракции, имеющие 5 -нукпеотидазную активность, объединяют (выход 310 мл) и концентрируют ультрафильтрацией.

Характеристика препарата: выход 90%, степень очистки - в 25 раз. Удельная активность препарата 5 -нуклеотидазы 60,0 ед/мг. Содержание фосфодиэстеразы 0,05% ( ед,/мг). Содержание неспецифической фосфомоноэстеразы 0,05% (./мг).

II р и м е р 2. К0,5г яда кобры добавляют 4 мл раствора 0,40 М сернокислого аммония (рН 7,0), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4°С, Растворенный яд центрифугиру- I ют при 5000 об/мин при 4°С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматог уравновеше 0 „4 „ аст. эи

уравновеше 0 „4 „ аст.

вором сернокислого-аммония ГрН 7,0) колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1%2,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,440 М раство- ром сернокислого аммония (рН 7,0) со скоростью 26 мл/ч, отбирают фракций по 13 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорд-П. Неспецифическая фосфомоноэстеряза, фосфодиэстераза, ри

бонуклеаза и основное количество белка проходят в данных условиях колонк а 5 -нуклеотидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, связывается на гептил-агарозе и ее элюируют 0,40 М сернокислого аммония при рН 7,0. Фракции, имеющие 5 -нукл отидазную активность, -объединяют (выход 305 мл) и концентрируют ультрафильтрацией. Удельная активность препарата 5 -нуклеотидазы 60,7 ед,/мг

Характеристика препарата: выход 90%, степень очистки - в 25 раз. Содержание фосфодиэстераэы 0,046% (2,8 к 10 ед./мг). Содержание неспецифической фосфомоноэстеразы 0,0007% (4,5.-10-4ед./мг)

Пример 3 КО,5 г яда кобры добавляют 4 мл раствора 0,45 М сернокислого аммония (рН 7,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, на- досадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную 0,45 М раствором сернокислого аммония (рН 7,5) колонку с гептил-ага- розой (размеры колонки 2,1 к2,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,45 М раствором сернокислого аммония (рН 7,5) со скоростью . 26 мл/ч, собирают фракции по 13 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорд- 11. Неспецифическая фосфомоноэсте- раза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза

/4801

и основное количество белка проходят

ю

в данных условиях колонку, а 5 -нукле- отидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, связывается на гептил-агарозе и ее элюируют раствором 0,45 М сернокислого аммония при рН 7,5, Фракции, имеющие 5 -нук- леотидазную активность, объединяют (выход 307 мл) и концентрируют ультрафильтрацией.

Характеристика препарата: выход 90%, степень очистки - в 25 раз. Удельная активность препарата 5 -нук- j леотидазы 60,1 ед./мг. Содержание

фосфодиэстеразы 0,042% (2,./мг)

0

5

0

5

Формула из

обретения

t

. Способ выделения 5 -нуклеотидазы из яда кобры, включающий растворение яда кобры в буферном растворе, центрифугирование с последующей очисткой супернатанта методом хроматографии с разделением от сопутствующих белков, отличающий - с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого продукта за счет разделения 5, -нукле- отидаз от неспецифической фосфомоноэстеразы, р астворение яда кобры осу- ществляют в 0,35-0,45 М буферном растворе сульфата аммония при рН 6,5-7,5, а хроматографическую очистку выполняют на гептил-агарозе в 0,35-0,45 М растворе того же буфера.

2. Способ поп„1,отличаю- щ и и с я тем, что центрифугирование проводят при 5000 об./мин.

0,2алI

ч

I

5

5j

I

3,0

и

w

i..

k I

%

%

i

t

i

n:

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению чистой 5 @ -нуклеотидазы яда кобры - специфического фермента, катализирующего гидролиз 5 @ -рибонуклеотида до рибонуклеозида и ортофосфата. Высокая специфичность 5 -нуклеотидазы делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот. Целью изобретения является упрощение способа и повышение чистоты целевого продукта за счет разделения 5 @ -нуклеотидазы от неспецифической фосфомоноэстеразы. Способ включает растворение яда кобры в буферном растворе с последующим центрифугированием и хроматографированием на гептил-агарозе с использованием в качестве буфера 0,35-0,45 М раствора сульфата аммония, PH 6,5-7,5. 5 -нуклеотидаза элюируется после основного количества белка. Выход - 90%, степень очистки - 25, содержание фосфодиэстеразы и неспецифической фосфомоноэстеразы - менее 0,05% активности 5 -нуклеотидазы. 1 з.п.ф-лы, 6 фиг.

200

Ш

600 Объе, мл