Способ получения пепсина рыб Советский патент 1991 года по МПК C12N9/50 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения препарата пепсина из внутренних органов рыб, который может найти применение в научно- исследовательской деятельности, медицине, пищевой и кожевенной промышленности.

Цель изобретения - повышение удельной активности целевого продукта и его выхода, а также упрощение способа.

Способ заключается о том, что в качестве сырьевого источника пепсина используют всю массу внутрених органов, содержащихся в брюшной полости рыб (желудок, кишечник, печень, почки и т.д.), которые гомогенизируют в растворе рН 2-6. Затем гомогенат инкубируют в течение 3-20 ч при комнатной температуре и центрифугируют в течение 30 мин при 19000 д, 4°С. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 1,7-2.4 и инкубируют 15-300 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 g в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а в последствии наносят на колонку с ДЭАЭ-носителем, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400-2800 ед/мг белка. Выход по активности равен 30-87%.

э ел

N3 CJ J hO

При проведении гомогенизации при рН выше 6 наблюдают понижение удельной активности целевого продукта. Аналогичный эффект наблюдают в растворах с рН ниже 2. Экстракция пепсина в течение менее 3 ч приводит к понижению выхода. В интервале 3-20 ч величина выхода не изменяется. 20-часовую экстракцию проводят в течение ночи, что позволяет более рационально проводить процесс. Дальнейшее увеличение времени экстракции нецелесообразно.

Инкубация ферментного раствора при рН выше 2,4 и ниже 1,7 приводит к понижению удельной активности целевого продукта и его выхода.

Время инкубации пепсина при кислых рН выбрано на основании того факта, что при инкубации меньше 15 мин удельная активность пепсина невысока. Вместе с тем инкубация в течение более 300 мин (по-видимому, за счет инактивации) понижает величину активности целевого продукта.

Пример1.175г внутренних органов мойвы гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5. Гомогенат инкубируют в течение 20 ч при комнатной температуре, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 19000 д, 4°С. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2 с помощью 2 н. HCI и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 g в течение 40 мин. Супернатант диализу ют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5. а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 ед/мг белка. Выход по активности равен 64%.

П р и м е р 2.175 г внутренних органов анчоуса гомогенизируют в 500 мл 10 мМ HCI, рН 2. Гомогенат инкубируют в течение 30 мин при 19000 д, 4°С. Для окончания реации активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствора центрифугируют при 19000д в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлоэой, уравновешенной тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 ед/мг белка. Выход по активности равен 87%.

П р и м е р 3. 175 г внутренних органов анчоуса гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 6. Гомогенат инкубируют в течение 4 ч при комнатной

температуре, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 19000 д, 4°С. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 1,7 с помощью 2 н. HCI и инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Для окончания

реакции активации рН поднимают до 4.4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 g в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ

ацетатного буфера, рН 5. а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-сферонитом, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по

отношению к гемоглобину равна 1500 ед/мг белка. Выход по активности равен 37%.

П р и м е р 4. 175 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 4. Гомогенат инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 19000 д, 4°С. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2,4 с помощью 2 н.НС и инкубируют 300 мин

при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствора центрифугируют при 19000 g в течение 40

мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-сфероном, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же

буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 2800 ед/мг белка. Выход по активности равен 30%.

45

Формула изобретения

Способ получения пепсина рыб. включающий гомогенизацию исходного сырья, активацию и очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта и его выхода, а

также упрощения способа, в качестве исходного сырья используют все внутренние органы из брюшной полости рыб, гомогенизацию ведут в растворе с рН 2-6 в течение 3-20 ч, активацию проводят при рН

1,7-2,4 в течение 15-300 мин, а очистку осуществляют методом ионообменной хроматографии на анионообменнике, содержащем диэтиламиноэтильные группы.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения пепсина из внутренних органов рыб. Цель изобретения -повышение удельной активности целевого продукта и его выхода, а также упрощение способа. Способ заключается в том, что в качестве сырьевого источника пепсина используется вся масса внутренних органов, содержащихся в брюшной полости рыб (желудок, кишечник, печень, почки и т.д.), которые гомогенизируют в растворе рН 2-6, Гомогенат инкубируют в течение 3-20 ч при комнатной температуре и центрифугируют. Значение рН супернатан- та доводят до 1,7-2.4 и инкубируют 15-30 мин при комнатной температуре. Значение рН доводят до 4,4 центрифугируют, диализу- ют и подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-носителе. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400-2800 ед/мг белка, выход по активности равен 30-87%. Ё