Способ определения степени активности воспалительного процесса при хронических бронхитах Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения степени активности воспалительного процесса при хронических бронхитах.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Мокроту забирают у больных натощак после санации ротовоп полости и гомогенизируют в стеклянной пробирке с тефлоновым пестиком с частотой вращения 200 об/мин в течение 20 мин. Го- могенат мокроты переносят в мерную центрифужную пробирку, приливают равное количество охлажденного физиологического раствора и тщательно перемешивают. Добавляют в количестве, равном 1/10 от общего гомогената, 1%-ный раствор тритона Х-100, пере- мешивают и оставляют в холодильнике на 15 мин, а затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин.

В две пробирки (опыт и контроль) берут по 1,0 мл субстратного раствора. В опытную пробирку приливают 0,1 мл (супернатанта), затем обе пробирки закрывают стеклянными пробками и инкубируют 1 ч при 37°С. После ин- кубации в обе пробирки приливают 2,0 мл 4%-ного раствора трихлоруксус- ной кислоты, перемешивают и в контроль приливают 0,1 мл надосадочной жидкости. Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Измеряют оптическую плотность в надосадке при длине волны 280 нм. Определяют активность катепсинов в расчете на содержание белка в надосадочной жид- кости по формуле

где Е - единицы экстинции;

К - коэффициент калибровки (К

0,42); С - содержание белка в пробе

(0,1 мл), мг (измеряется в нМ тирозина ч белка. Используют следующие реактивы для определения катепсинов.

1.Субстратный раствор. 4,8 г мочевины растворяют в Ь,2 мл дистиллированной воды, добавляют 800 мг гемоглобина, тщательно перемешивают. В за крытой стеклянной посуде инкубируют

2 ч при ЬО°С. Затем к раствору приливают 30 мл ацетатного буфера рН4,0

2.Ацетатный буфер рН 4,0. Берут 73,4 мл 1 N уксусной кислоты и приливают 50 мл 1 N едкого натра и дово-

дят объем до 500 мл дистиллированной водой.

Пример 1. Больная В., 40 лет поступила с жалобами на кашель с отделением вязкой светло-зеленой мокроты около 100 мл/сут., одышку при физической нагрузке. Страдает хроническим бронхитом 14 лет с ежегодными обо

о 5

д

0

5

стрениями, настоящее обострение последние 3 недели. При поступлении состояние удовлетворительное, температура тела - 36,8°С. В легких легочный ЗВУК, дыхание везикулярное, с обеих сторон грубые сухие хрипы. Со стороны других органов патологии не выявлено. На рентгенограмме органов грудной клетки с обеих сторон легочный рисунок усилен, перестроен, фиброзные изменения корней легких. При бронхо-4 скопин обнаружено: слизистая оболочка бронхов обоих легких гиперемирова- на, рыхла, просвет бронхов сужен за счет рыхлой, отечной слизистой. Отделяемое слизисто-гнойное. При спирографии изменений функции внешнего дыхания не выявлено: МЕЛ - 3,8 л - 107% ДЖЕЛ; МОД - 16 л - 115% ДИОД; МВЛ - 61,6 л - 83% ДМВЛ; ФЖЕЛ, - 2,33 л, индекс Тиффно - 75%. Пневмотахометрия выдоха - 3,9 л/с. Общий анализ крови: эритроциты 4,Ь 10 /л; гемоглобин 150 г/л; лейкоциты - 7,9 10 /л; лейкоцитарная формула без изменений; СОЭ - 8 мм/ч. Биохимическое исследование крови: СРВ - отрицательный; сиа- ловые кислоты - 2,3 ммоль/л; серомуко- ид - 0,13 ед.; фибриногея - 2,4 г/л; альбумины - 47%; глобулины - 7,7%; L - 11,3%; ft- 13%; f - 21%. Иммуноглобулины крови: IgA - 1,91 г/л; IgM - 0,99 г/л; IgL - 13,4 г/л. Общий анализ мокроты: слизисто-гнойная, вячкая лейкоциты 30-40 в поле зрения.

Общая активность катепсинов в мокроте составила 465,3 нМ тирозина белка. Клинический диагноз: хронический гнойный необструктивный бронхит в фазе обострения, III степень активности. Перибронхиальный пневмосклероз. Назначенное лечение (гентамицин, санационные бронхоскопии с введением 0,1%-ного раствора фурагина № 5, пре- социл, аутогемотерапия, эуфиллин, отхаркивающая микстура с термопсисом) принесло значительный клинический эффект: значительно уменьшился кашель, количество мокроты около 25 мл/сут., светлая. В легких исчезли сухие, хрипы. При бронхоскопии отмечена положительная динамика: значительно уменьшилась гиперемия, отечность слизистой бронхов, остается небольшое количест- Ёо слизисто-гнойного отделяемого единичными мазками. Активность катепси- нов мокроты уменьшилась до 88,6 нМ

15

тирозина белка. На 17-й день больная выписана из стационара.

В данном примере наиболее информативными методами в оценке степени активности воспаления явилась бронхоскопия и исследование катепсинов мокроты. Установление III степени активности воспаления в данном примере предопределило интенсивность антибактериального и противовоспалительного лечения с применением санацион- ных бронхоскопий. Значительное улучшение состояния больной и уменьшение- активности воспаления в бронхах четко коррелирует с уменьшением активности катепсинов в мокроте более, чем в 5 раз.

П р и м е р 2. Больной М., 52 г., поступил с жалобами на приступообразный кашель с одблением слизисто-гной- рой мокроты около 150 мл/сут, одышку в покое и при небольшой физической нагрузке временами приступообразного характера. Страдает хроническим бронхитом более 20 лет с практически ежегодными обострениями. Бронхообструк- тивный синдром около 8 лет, год назад диагносцированы бронхоэкстазы. Настоящее обострение в течение последних двух недель. При поступлении состояние удовлетворительное, температура тела - 36,7°С. Акроцианоз губ. Число дыханий - 24 в 1 мин. Грудная клетка бочкообразная, перкуторно-ле- гочный звук с коробочным оттенком, жесткое везикулярное дыхание, в большом количестве грубые( и свистящие сухие хрипы на вдохе и выдохеj выход несколько удлинен. Тоны сердца приглушены, ритм правильный, частота пульса - 100 уд./мин, артериальное давление - 170/110 мм рт.ст. Печень не пальпируется. Отеков нет. На рентгенограмме органов грудной клетки легочная ткань повышенной прозрачности, усиление и перестройка легочного рисунка по ячеистому типу. Бронхоскопия не проводилась из-за сопутствующей гипертонической болезни 11Б стадии. При исследовании функции внешнего дыхания определяются резкие изменения по обструктивному типу: МОД - 21,1 л - 210% ДИОД; ЖЕЛ - 2,51 л-63% ДЖЕЛ; МВЛ - 35,2 л - 35% ДШШ; ФЖЕЛ, - 0,97 л; индекс Тиффно - 38%. Пневмотахометрия выдоха - 1,1 л/с. ЭКГ: синусовый ритм, отклонение электрической оси сердца впра3456

во. Гипрпгрофия правого предсердия. Общий анализ крови: эритроциты - 4,3-10г /л; гемоглобин - 132 г/л, лейкоциты - 4,4 10 /л, лейкоцитарная формула без изменений; СОЭ - 10 мм/ч. Биохимическое исследование крови: альбумины - 49,3 %; глобулины: Lf - b,1%, L4 - 10,5%, р- 14,1%, у 20,0%, СЛ Б + +, сиаловые кислоты - 2,87 ммоль/л, серомукоид - 0,27 ед. Иммуноглобулины крови: IgA - 0,54r/i; IgM - 0,12 г/л; IgG - 20,7 г/л. Общий анализ мокроты: светло-желтая,

слизистая, лейкоцитов много в поле зрения.

Общая активность катепсинов в мокроте составила 201,8 нМ тирозина ч . мг белка.

0 Основной клинический диагноз: хронический гнойнообструктивный бронхит с бронхоэктазами в фазе обострения, II-я степень активности. Диффузная эмфизема легких. Иневмосклероэ. Но5 еле проведенной терапии (диоксицин, фурагин, теофедрин, теоникол, ингаляция с эуфиллином и эфедрином, отхаркивающая микстура с термопсисом, массаж грудной клетки, кальций и эуфил0 лип, электрофорез на грудную клетку) самочувствие больного улучшилось: уменьшился кашель, количество мокроты - до 50 мл/сут. В легких количество сухих хрипов значительно уменьшилось. Пневмотахометрия выдоха увеличилась до 2,4 л/с. В общем анализе крови без патологии. Активность катепсинов в мокроте уменьшилась более, чем в 2 раза - до 98,4 нМ тирозина

Q мг белка. Больной выписан из стационара на 19-й день лечения.

В данном клиническом примере установление 11-й степени активности воспаления на основании клинических и

с лабораторно-биохимич еских признаков предопределило менее интенсивную про-, тивовоспалительную терапию, чем в предыдущем случае.

II р и м е р 3. Больной С., 51 г.,

Q поступил с жалобами на кашель с мокротой светло-желтого цвета около 70 г/сут., небольшие боли справа в грудной клетке, потливость, температура до 38°С. Страдает хроническим бронхитом около 8 лет, настоящее обо5

5

стрение около месяца. При поступлении состояние удовлетворительное. Температура тела 37,5ffC. Число дыханий - 18 в 1 мин. Грудная клетка цилиндрическая. Перкуторно-легочный звук с коробочным оттенком, при аус- культации жесткое везикулярное дыхание. Хрипов нет. Тоны сердца приглу- шены, ритм правильный, негрубый сиетолический шум на верхушке, частота пульса 62 уд./мин, артериальное давление 115/75 мм рт.ст. Печень не пальпируется. Отеков нет. На рентге-

нограмме органов грудной клетки: легочный рисунок в прикорневых зонах перестроен с участками склероза, корни малоструктурны, справа в верхней доле ограниченный фиброз. При иссле- довании функции внешнего дыхания определяются начальные изменения по смешанному типу: ЖЕЛ - 2,95 л - 86% ДЖЕЛ; МВЛ - 63,4 л - 74% ДМВЛ; ФЖЕЛ4 2,24 л, индекс Тиффно - 76%. Вронхо- скопил (на 11-й день лечения): слизистая оболочка бронхов легких обоих умеренно гипере мирована. Отделяемое скудное светлое в бронхах обоих легких. ЭКГ - суносовый ритм, нормаль- ное положение электрической оси сердца. Общий анализ крови: эритроциты - 4,3« 10Л/л; гемоглобин - 140 г/л; лейкоциты - 7, лейкоцитарная формула без изменений; СОЭ - 10 мм/ч Биохимическое исследование крови: СРВ - отрицательно; сиаловые кислоты 1,8 ммоль/л; серомукоид 0,14 ед. Иммуноглобулины крови: IgA - 2,-73 г/л; IgM - 0,9 г/л; IgG - 23,5 г/л. Общий анализ мокроты: светлая, вязкая, слизистая, лейкоциты 4-5 в поле/зрения, макрофаги - 0-2, грамположительные кокки - немного, грамотрицательные палочки - умеренное количество.

Общая активность катепсинов в мокроте составила 102,3 нМ тирозина ч белка, что соответствует 1-й степени активности воспаления. Основной клинический диагноз: хрони- ческий бронхит в фазе обострения, 1-я степень активности. Пневмоскле- роз. Дыхательная недостаточность 0- 1 ст. После проведенного лечения (мо номицин, сульфален, бутадион, алое , отхаркивающие средства, индуктотерми на грудную клетку, массаж грудной клетки) самочувствие значительно улушилось: жалоб нет, температура тела нормальная. В легких хрипов нет. Выписан из стационара в удовлетворительном состоянии на 17-й день лечения.

Q

0 5 0 п

5 5

0

Предлагаемый способ диагностики был применен у 54 больных хроничес- i ким бронхитом, из них по критериям М.М.Миррахимова, Н.Н.Бримкулова 1-я степень активности определялась у 16; П-я - у 23 и III-я - у 15 больных. Активность катепсинов в мокроте у .больных хроническим бронхитом составила () при активности воспаления

1-й степени - 54,9+6,0 нМ тироз и- на-ч белка,

11-й степени - 196,9+13,4 нМ ти- розина-ч . мг белка,

111-й степени - 440,2429,1 нМ . -1 -1 , тирозина ч мг белка.

При определении граничных значений по формуле Mt2tf для каждой из трех групп обследованных получается частичное наложение определяемых интервалов как между I и II, так и меж4- ду II и III группами. Однако, учитывая высокодостоверную разницу (Р- 0,001) между средними величинами каждой из групп обследованных, возможно определение крайних значений для II группы обследованных с дополнительной поправкой на величину, раную 3 M(j (м(у - ошибка сигмы) с достоверностью ,001.

Итак, при (,8 нижняя граница для второй группы равна М,„ -2G4 +3мр 131,1 130 расч. ед. , верхняя граница - И „ +26 -3Mff 262,3 2:260 расч. ед.

Таким образом, со значимостью Р 0,001 можно утверждать, что нижнее граничное значение для II группы будет 130, а верхняя граница - 260.

С целью объективизации оценки активности катепсинов мокроты как показателей активности воспаления при хронических бронхитах было проведено определение ложноположительных и лож- ноотрицательных результатов. Для верификации результатов исследования катепсинов в качестве эталона сравнения использовались клинико-эндоскопические критерии активности воспаления. Результаты приведены в таблице.

Приведенные данные свидетельствуют о высоком проценте истинно положи-1 тельных результатов активности катепсинов мокроты в каждой группе обследованных.

Таким образом, более точное установление степени активности воспалительного процесса методом исследования катепсннов в мокроте при хронических бронхитах позволяет назначить индивидуальную адекватную терапию при обострении заболевания, определяет интенсивность и длительность противовоспалительной и антибактериальной терапии. Способ также позволяет контролировать эффективность лечения и является простым и полностью безо

пасным для больного.

s.%

Формула изобретения

Способ определения степени активности воспалительного процесса при

хронических бронхитах путем биохимического исследования мокроты, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, определяют уровень активности катепси- нов и при его значении 130 нМ тирози- на/Ч МГ белка и менее определяют I степень, 131-260 нМ тирозина/ч-мг белка - II степень, а более 260 нМ тирозина/ч«мг белка - III степень

активности воспалительного процесса .

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения степени активности воспаления при хронических бронхитах. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого у больных хроническим бронхитом натощак забирают мокроту, гомогенизируют ее, разбавляют в 2 раза физиологическим раствором, добавляют 1%-ный раствор тритона Х-100 в количестве, равном 1/10 от объема пробы, охлаждают и центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин. В надосадке определяют активность катепсинов по расщеплению ими гемоглобина. Для этого к 0,1 мл супернатанта приливают 1,0 мл раствора, содержащего 20 мг/мл гемоглобина в ацетатном буфере, с PH 4,0 с добавлением 120 мг/мл мочевины. Пробирку инкубируют в закрытом виде 1 ч при 37°С, приливают 2,0 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. Контрольная проба от опытной отличается тем, что в контроле @ 0,1 мл супернатанта мокроты вносится в пробирку после добавления трихлоруксусной кислоты. В пробах определяют оптическую плотность при длине волны 280 нм и рассчитывают активность катепсинов по формуле A = E/к^.C, где A - активность катепсинов в мокроте, выражается в нМ тирозина/ч^.мг белка

К - коэффициент калибровки, равный 0,42

C - концентрация белка в пробе, мг

E-единицы экстинции. При показателях A меньше 130 нМ тирозина/ч^.мг белка устанавливают I степень, 130-260-II степень и с

Примечание. Р- достоверность между истинно положительными и ложнопо-- ложительными и ложноотрицатель- ными результатами.

Редактор А.Лежнина

Составитель А.Яхьяев

Техред А.Кравчук Корректор М.Кучерявая

Заказ 398

Тираж 506

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101 .

Подписное