Способ регенерации растений подсолнечника Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выращиванию растений in vitro, более конкретно оно относится к способу регенерации растений подсолнечника из незрелых зародышей путем саматическо- го эмбриогенеза,

Известен ряд работ по регенерации растений подсолнечника . Так, известно получение регенерантов из сегментов солядо- лей и гипотиля, апексов побегов.

Недостатком данного способа является невысокий выход регенератив при высокой трудоемкости культивирования/

Известен также способ регенерации побегов подсолнечника из незрелых зародышей.

Однако данный способ не о6еспечив;ип стабильного получения растений-регтт- рантов.

Известен способ получения регенерли тов подсолнечника из незрелых зародышей путем их предварительной эксплантации и получения из них фертильш ix растений.

Однако данный способ не позполнег получить массовую регенерацию растений ввиду низкого коэффициенту размножения при использовании данного метода

Цель изобретения повышение выхода регенерантов, а также пш чшеиие частоты образования зон эмбриог - рфоге.неэа.

-ч

ю

vj (Л

GO

Поставленная цель достигается путем использования трех последовательных этапов: первый этап образования эмбриоген- ных каллусов из клеток или тканей путем культивирования в питательной индуцирую- щей среде, содержащей гормон; второй этап культивирования эмбриогенных каллусов для их роста, из развития и их прораста- ния в среде, содержащей гормон; в известных случаях, третий этап, состоящий в культивировании, позволяющем осуществлять рост и развитие растений; два первых этапа осуществляют в среде одной и той же природы и эта среда содержит гормон пито- кининового типа без гармона ауксина.

Растительные ткани, откуда можно извлекать эксплантаты для продуцирования соматических зародышей, происходят из культиваторов подсолнечника Hellanthus annuus, используемых главным образом в программах селекции. В качестве примера использовали 8 культиваторов (сортов), НА 89, НА 290, НА 291, НА 300, НА 303, Т 76, РТ 26 и Giant Gray stripe Сорт НА 89 происходит от Dade Counts Флорида, сорта НА 290, НА 291. НА 300. НА 303, Т 76, и РТ 26 происходят от Scedtec International I he Калифорния, и Giant Gray stripede northrup Kind seeds Калифорния.

Эксплантаты происходят от растений, культивируемых в теплице и подвергнуты контролированному оплодотворению. Предпочтительным эксплантатом для продуцирования каллуса является недоразви- тый зародыш. Недоразвитые зародыши с околоплодниками выделяют из головок подсолнечника, когда они имеют возраст 4-21 день, их размер обычно составляет 0..1-5 мм. Недоразвитые зародыши значительно- го размера могут, быть разрезаны на несколько равных частей согласно плоскости, проходящей по оси перышка зародышевого корешка, что размножает число клонов , полученных из одного зародыша..

Спошб согласно изобретению осуществляется следующим образом.

Сорта подсолнечника НА 89, НА 290, НА 291. НА 300. НА 303, Т 76, РТ26 и Giant Gray Stripe культивируют -в теплице (26°С, 40 000 лк, фотопериод 15 ч в 1 день) и подвергают контролируемому оплодотворению. Недоразвитые зародыши извлекают спустя 4-21 день после опыления. Отделенные от головок зерно стерилизуют путем погружения на 20 мин в раствор жавелевой воды с 3° CI, в который добавлено несколько капель смачивателя, затем промывают 3 раза стерильной дистиллированной водой. Зародыши затем изолируют в асептических условиях, в известных случаях разрезают и помещают

в первую среду - среду индукции зародышей.

Эта первая среда включает минеральные соли, витамины, аминокислоты,сахарозу и гормон в количестве, достаточном для. образования каллуса. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли оли- гоэлементов. Макроэлементы, используемые в этой первой среде, могут быть выбраны, например, среди следующих соединений: сульфат магния, хлорид кальция, монофосфат калия, нитрат калия и нитрат аммония. Из солей на основе олигозлемен- тов можно назвать: борная кислота, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдан натрия, сульфат меди (II),хлорид кобальта-, иодид калия и хелат желеэа-Ма-ЭЛТК. Эта комбинация минеральных солей известна под названием Murashige и Skoog (MS).

Предпочтительные количества макроэлементов и олигоэлементов на. 1 л среды следующие, мг: 370 гептагидратированный сульфат магния, 440 дигидратированный хлорид кальция, 170 дигидративный моносульфат калия, 1900 нитрат калия, 1650 нитрат аммония, 6,2 борная кислота, 22,3 тетрагидратированный сульфат марганца, 8,6 гептагидратированный сульфат цинка, 0,25 дигидратированный молибдат натрия. 0,025 пентагидратированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированкый хлорид кобальта, 0,83 иодид калия, 36,7 хелат железо- Na-ЭТЛК.

Первая среда содержит также витамины, такие как никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин, мио-инозитол, и аминокислоту, такую как аланин, глутамин, серии, триптофан, цистеин и предпочтительно глицин. Предпочтительными количествами витаминов и аминокислот на 1 л среды являются, мг: 0,5 никотиновая кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 100 мио-инозитола, 2 глицина.

Первая среда также может содержать добавку витамина и аминокислот. Эта добавка не является необходимой для образования соматических зародышей, но она увеличивает их частоту. В этом случае предпочтительными количествами витаминов и аминокслот на 1 л среды являются , мг: 0,5 никотиновая кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 4000 мио- ниозитол, 1000 1-аланин, 800 1-глутамин, 160 1-серин, 50 триптофан, 10 1-цистеин; 2 глицин.

Сахароза, содержащаяся в первой среде, имеется в количестве 8-12%, предпочтительно 9%.

Гормон первой среды, выбор которого является характеристикой изобретения пит& ининового типа, например кинетин или 6-бензиламинопурин, и предпочтительно последний. Обычно пригодны количества 0,5-1 мг на 1 л среды. Агар, Phytagar или Gelrite используется для создания твердой среды. Конечная концентрация 0,6% для Phytagar или 0,3% для Gelrite дает хорошие результаты. рН-значение среды может меняться от 5,0 до 6,3 в предпочтительно составляет 5,0. .

Среду стерилизуют в автоклаве за исключением гормонов, которые стерилизуют путем фильтрации через микропористую мембрану.

Недоразвитые зародыши, выделенные как описано выше, помещают в эту первую среду, культивируют в течение около 2-3 недель в темноте при 26°С. В течение этого периода зиготические зародыши развиваются и соматические зародыши появляются на уровне гипокотиля и на внутренней поверхности семядолей в случае культи&ара (сорта) ПА 291. Затем соматические зародыши могут быть изолированы и помещены во вторую среду-среду роста проростков. Эм- бриогенный каллус или выделенные зародыши культивируют во второй среде в течение 2-8 недель при 26°С и на свету (1500 лк) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. В течение этого периода зародыши прорастают и образовавшиеся ростки развивают в известных случаях.корни.

Вторая среда, как и первая, содержит минеральные соли, витамины/аминокислоту, сахарозу и гормон. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли оли- гоэлементов. Макроэлементы, олигоэле- менты, витамины и аминокислота те же, что и в первой среде, и идентичных концентрациях без добавлений. Сахароза имеется в количестве предпочтительно ниже такого первой среды, например 2-4%, предпочтительно 3%.

Используемым гормоном является ци- тонинин, предпочтительно идентичный или отличный от первой среды, предпочтительно 6-бензиламйнопурин. Обычно пригодны количества 0,1-0,5 мг на лист. Агар Phytagar или Gelrite используется для создания твердой среды. Конечная концентрация 0,6% для Phytagar и 0,3% для Gelrite дает хорошие результаты. Среду стерилизуют как и ранее, рН среды 5,0-6,8, предпочтительно рН 5,0.

Спустя 2-5 недели пребывания во второй среде, выделенные соматические зародыши прорастают и превращаются в ростки 2-5 см. Ростки, которые развили корни, могут быть высажены в землю, стерильную

смесь торфа, вермикулита, тонкодисперсного песка (3:2:1), содержащуюся в горшках Jibbi. Горшки помещают в бак,. запоппем- ный влажным песком, и покрывают пролрач- 5 ным полиэтиленовым пакетом для поддержания высокой степени влажности. Всю совокупность помещают в климатическую камеру с температурой 15°С (6000 л к) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпоч0 тительно 15 ч в 1 день. Спустя 10 дней растения помещают в более крупные горшки и культивируют в теплице при 26°С (40000 л к) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпоч- тител ьно 15 ч в 1 день.

5Растения, которые не развили корней,

могут быть привиты к молодым растениям, культивируемым в теплице, согласно классическому методу либо помещены на период 10-20 дней в среду для укоренения или н

0 третью среду.

Третья среда включает минеральные соли, витамины и сахарозу. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли оли гоэлементов. Используемые в этой третьей

5 среде макроэлементы могут быть выбраны среди следующих соединений сульфат магния, хлорид кальция, мононатрийфосфат. нитрат калия и сульфат аммония. Среди солей на основе олигоэлейентов можно на

0 звать борную кислоту, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдат натрия, сульфаг меди-(II), хлорид кобальта, иодид калия и хелат Fe-Na-ЭТЛК. Эта комбинация миме ральных.солей известная под названием В

5 5. Предпочтительные количества макроэлс ментов и олигоэлементов на 1 литр среды следующие мг,: 250 гептагидратированный сульфат магния, 150 дигидратированный хлорид кальция, 169 моногидратированный

0 мононатрийфосфат, 3000 нитрат калия, 3 борная кислота, 13,2 тетрагидратирован- ный сульфат марганца, 2. гептагидратированный сульфат цинка,- 0,25 дигидратированный молибдат натрия, 0,025

5 пентагидрэтированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта, 0,75 иодид калия, 40 хелатэ Fe-Na

эдтк.

Третья среда также содержит витамины.

0 Это никотиновая кислота, тиамин, пиридок- син, и мио-инозитол. Предпочтительными количествами витаминов на 1 л среды являются, мг: 1 никотиновой кислоты, 10 хлоргидрата тиамина, 1 хлоргидрата пиридоксина и 100

5 мио-инозитола.

Третья среда содержит также сахарозу и активированный уголь и/или гормон аук- синового типа. Сахароза имеется, например, в количестве 1-2%. предпочтительно 1%, а активированный уголь в количестве

0,1 %. Если использовать гормон вместо активированного угля, то выбирают 3-индол- уксусную кислоту в дозах OJ-0.2 мг на 1л. Агар Phytagar или Gel rite. ИСПОЛЬЗУЮТ для создания твердой среды . Конечная концентрация 0,5% для Phytagar и 0,25% для Gelrite достаточная. рН среды может изменяться от 5.0 до 6.0 и предпочтительно составлять 5,0. Среду стерилизуют в автоклаве.

Растения культивируют в этой среде в течение 2-3 недель при 26°С на свету (1500 л к) с фотопериодом Т2-Шв 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. Растения образуют корни и могут быть высажены в землю.

Полученные этим способом растения могут быть фенртипически отличными от исходного материала вследствие стресса ин витро. Растения опыляют вручную и выдерживаются вплоть до сбора семян. Несколько единиц зерен сажают для анализа новых растений подсолнечника и селекции возможных интересных мутантов, которых затем вовлекают в программу селекции разновидностей;

Пример 1, Приготовление маточных растворов

а.Маточный раствор В5. Маточный раствор В5, концентрированный десятикратно, готовят растворением пакетика со средой В5 без сахарозы Flow Laboratories (содержит минеральные соли В5, 1 мгникотиновой кислоты, 1 мг пиридиксина - Н01, 10 Мл триамина. HCI и 100 мг инозитола. в конечных концентрациях) в 100 мл (конечный объем) дистиллированной в деионизированной воды. Маточный раствор разделяют на алик- воты по 100 мл и хранят при -20°С.

б.Маточный раствор ВАР. Раствор ВАР с 1 г/л готовят путем растворения 100. мг б-бензиламинопурина в нескольких мл 0,15 и HCI, слегка нагревая, и разбавления 100 мл дистиллированной и деионизированной воды. Этот раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану Mlnisart NML 0.2 микрона (Sartortus) перед его добавлением к первой и второй средам.

в.Маточный раствор А1 А. Раствор А1А с 0,2 г/л готовят растворением 20 мг 3-ин- дол-уксусной кислоты в нескольких миллиметрах чистого этанола и разбавлением 100 мл дистиллированной и деионизированной воды. Этот раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану Mlnlsart NML 0,2 мкм (Sartorlus) перед добавлением к третьей среде.

г. Добавка витамина и аминокислот согласно Chandler и BEARD.

Исходный раствор витамина и аминокислот, двадцатикратно концентрированный, готовят растворением совокупности 30 г мио-инозетола 10 г L-аланина, 8 г L-глута- мина, 1,6 г L-серина, 0,5 L-триптофана и 0,1 г L-цистеина в 500 мл (конечный объем) дие- тиллированной и деионизированной воды. Исходный раствор разделяют на аликвот- ныё части по 50 мл и хранят при -20°С . П р и м е р 2. Приготовление сред.

а.Первая среда или среда индукции за- родышей. Среду готовят растворением пектина со средой Murashlge и Skoog без сахарозы Flow Laboratories, содержит минеральные соли MS 0,1 мг тиамина, HCI 0,5 мг никотиновой кислоты, 0,5 мг пиридоксина.

HCI, 2 мг глицина и 100 мг инозитола и 90-120 г сахарозы в дистиллированной и деионизированной воде. После возможного добавления 50 мл добавки витамина и аминокислот, рН доводят до 5,0 с помощью 0,1

н. раствора гидроксида натрия, обьем доводят до 1 л и после добавления 6. г Phytagar (Clbco) или 3 г Gelrite (Kelco) смесь выдерживают в автоклаве в течении 20 мин при 120 psi. Когда смесь остыла, в нее добавляют

0,5-1 мл раствора ВАР (2,2-4,4 мкмоль), стерилизованного, как описано выше. Смесь затем выливают в чашки Петри.

б.Вторая среда или среда роста проростков. Вторую среду готовят идентичным

первой среде образом, растворяя совокупность пакетика со средой М, 30 г сахарозы и 6 г Phytagar или 3 г Gelrite в 1 л воды, добавляют после выдерживания в автоклаве 0,1-0,5 мл стерильного раствора ВАР

(0,44-2,2 мкмоль). Среду выливают в чашки planteon (Flow Laboratories).

в.Третья среда или среда укоренения. Третью среду готовят добавлением 1020 г сахарозы на 100 мл исходного раствора

В5, в дистиллированной и деионизированной воде. рН доводят до 5,0 с помощью 0.1 н. раствора гидроксида натрия, затем объем доводят до 1 л и добавляют смесь 0,5 г Phytagar и 1 г алкированного .угля. После

прохождения автоклава, среду выливают в Mason jars. Если хотят использовать третью среду, содержащую А1А, то активированный уголь не употребляют во время приготовления этой третьей среды. После

прохождения автоклава в остывшую среду добавляют 0,5-1 мл стерильного раствора А1А (0,57-1,14 мкмоль). Среду выливают идентичным образом в Mason jars.

Жидкий вариант третьей среды включает только минеральные соли в 5 м 1 % сахарозы, при рН 5,0. Смесь распределяют на фракции по 10 мл в стеклянные трубки, содержащие мостики из фильтровальной бумаги, согласно способу, описанному

CHANDLER и BEARD, затем выдерживают.в автоклаве.

П р и м е р 3. Недоразвитые зародыши с их околоплодниками отделяют от головки подсолнечнике (Hellanthus annuus, разновидность Т76В), когда они достигают размера 0,5-1,5 мм. Зерна стерилизуют в течении 20 мин в растворе кавелевой воды в с 3° С и споласкивают дистиллированной водой. Недоразвитые зародыши отделяют от их оболочек и помещают в чашки Петри на первую среду. Первая среда получена описанным образом, с 90 г/л сахарозы и 0.5 мг/л В АР (2,2 -мкмоль).:

Чашки Петри инкубируюг в темноте в течение 3 недель для того, чтобы привести к образованию соматических зародышей.

В этой стадии, соматические зародыши, которые начали прорастать, отделяют от зи- готического зародыша и помещают на вторую среду в чашки Planteon. Вторая среда, приготовленная как описано выше, содержит 0,1 мг ВАР на 1 л или 0,44 мкмоль. Зародыши культивируют на свету в течение 3 недель и они дифференцируются по росткам.

Ростки высотой 2-5 см затем переносят на третью среду для инициирования образованием корней. Третья среда, приготовленная как описано выше, содержит предпочтительно 10 г сахарозы. В случае застудневания среды добавка 1 г/л активированного угля удаляет остаточное влияние ВАР, осуществляемое в предыдущей среде MAENE .И DEBERGH, Plant CEII Tissue Organ Culture и благоприятствует быстрому росту корней. Спустя примерно 2 недели ростки могут быть высажены в землю.

Если ростки начали развивать корни на второй среде, то они могут быть введены в контакт с третьей жидкой средой, согласно технике, описанной. CHNDLER и BEARD. Это устройство позволяет значительно развивать корневую систему и избегать повреждения корней во время высадки в землю.:

Пример 4. Недоразвитые зародыши HeJianthus annuus разновидность НА 89 отбирают, когда они достигают роста 0,1-0,5 мм, с эндоспермом на первую среду. Первая среда содержит 90г сахарозы и 0,5 мг ВАР на 1 литр или 2,2 мкмоль. Спустя 3 недели в темноте соматические зародыши изолируют и помещают на первую свежую среду все время в темноте. Вторичные соматические зародыши образовываются на изолированных зародышах. Спустя 3 недели пребывания в темноте вторичные соматические зародыши изолируют и помещают на вторую среду. Вторая среда содержит 30 г харозы и 0,1 мг на 1 л (0,44 мкмоль).

Ростки, которые развиваются. затем могут быть перенесены на третью сроду жид 5 кую или, подвергнутую засгуднепапию длч укоренения, затем будут пересажены н зем- лю.

Пример 5. Недоразвитые зародыши Helianthus annuus, разновидность НА 89 от 0 бирают спустя 21 день после опыления, они размер 5 мм. Их отделяют от их оболочек и до внесения на первую среду разрс зают на четыре равные части продольно согласно двум перпендикулярным плоско 5 стям между ними и параллельным оси перышка первичного корешки. В этом случае первая среда содержит.90 г сахарозы и 1мг ВАР на 1 л. Спустя 3 недели в темноте сома тические зародыши изолируют и помещают 0 на вторую среду. .Вторая среда содержит 30 г сахарозы и 0,5 мг ВАР на 1 л.

Ростки, которые развиваются, затем могут быть перенесены на третью среду (жидкую или подвергнутую застудневанию) для 5 укоренения, затем высажены в землю. Ростки, которые не имеют корней, могут оыгь привиты к молодому растению согласно мо тоду,описанному HABEIMANN и WaLl.acn.

Примеры 6-27. Приведенные приме- 0 ры дают комбинации, которые можно осу ществлять, используя различные описании : примеры.

Предлагаемый способ позволяет получить массовую регенерацию растений под- 5 солнечника из незрелых зародышей путем соматического эмбриогенеза.

В таблице представлены результаты исследований действия способа на различных линиях подсолнечника. 0Формул а изобретения

1. Способ регенерации растений подсолнечника, включающий три последовательных этапа, при этом первый этап

5 предусматривает получение из эксплантоп эмбриогенных каллусов и соматических ом- бриоидов с последующим их ростом ил модифицированной питательной среде Мурасиге - Скуга, второй этап - формиропа0 ние проростков и развитие их в растения на модифицированной питательной среде Мурасиге - Скуга и третий этап - формирование и рост корней у полученных растений на питательной среде, содержащей источники

5 азота, фосфора, калия, углерода, микроэлементы, витамины и стимуляторы роста, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода регенерантов, в качестве эксплан- тов используют незрелые зародыши в возрасте от 4 до 21 дня размером 0,1-5 мм.

первый этап осуществляют на питательной среде в присутствии 2,2- 4,4 моль/л 6-бензи- ламинопурина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0.1 мг/л хлоргидрата тиамина, 0,5 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоино- зитола, 2 мг/л глицина.при содержании сахарозы 9-12%, второй этап осуществляют в присутствии 0,44- 4,4 ммоль/л 6-бензила- минопурина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,1 мг/л хлоргидрата тиамина, 0,5 мг/л хлор- гидрата пиридоксина, 100 мг/л миокнозито- ла, 2 мг/л глицина, при содержании сахарозы 3%, третий этап осуществляют на 1 мг/л модифицированной никотиновой кислоты, 10 мг/л хлоргидрата тиамина, 1 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоино- зитола, 0,1-0,2 мг/л индолил-3-уксуской кислоты, при содержании сахарозы 1-2%, при этом после второго этапа полученные растения прививают,2. Способ по п. 1. j т л ичающийся тем, что, с целью поьышения

частоты образования зон эмбрио-4 морфогенеза, на первом этапе в питательную среду дополнительно вносят 3900 мг/л

миоинозитола, 1000 мг/л L-эланида, 160

мг/л L-серина, 800 мг/л L-глутамина, 50

мг/л L-триптофана, 10 мг/л L-цистеина.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающи- и с я тем, что используют линии подсолнечника Т 76, РТ26, НА 89, НА 291, Giant Gray Strlne.

4.Способ по пп. 1-3, отличаю щи й- с я тем, что после второго этапа растения,

имеющие корни, высаживают в землю и инкубируют в климатической камере при 15°С, интенсивности освещения 6000 лк с 15-часовым фотопериодом.

Изобретение относится к биотехполо гии, о частности к выращиванию растений in vitro, а более конкретно к способу регенера- ции растений подсолнечника из незрелых зародышей путем соматического эмбриоге неза. Целью изобретения является повыше ние выхода регенератов, а также повышение частоты образования зон эм( рио- и морфогенеза. Способ предусматри вает получение из незрелых зародышей соматических эмбриоидов и последующую регенерацию из них побегов на модифици рованных средах Мурасиге-Скуга и дат, нейшее корнеобразование H.I модифицированной среде Гамборга Вг, Способ позволяет получить массовую регенерацию растений подсолнечника. 3 з.п.Ф- лы, 1 табл. (Л С